In-vitro- und In-vivo-Untersuchungen zur Hemmung der PLA 2 mit Hilfe von antisense-Oligonukleotiden:
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
I EINLEITUNG.1
1.1 ENZYMFUNKTION DER PHOSPHOLIPASEN
.1
12 INHIBITOREN DER PLA
2YY.11
1.3 ANTISENSE-OLIGONUKLEOTIDE ALS INHIBITOREN DER PLA
2.13
1.4 ZIELSETZUNG
.19
II
MATERIAL UND METHODEN.21
1 CHEMIKALIEN UND ENZYME.21
2 LOESUNGEN UND PUFFER.21
3 BAKTERIENSTAMM UND BAKTERIENKULTUR.22
4 ZELLINIEN UND ZELLKULTUR
.22
4.1 HEPATOKARZINOMA-HEPG2-ZELLINIE
.22
4.2 U 937- ZELLINIE
.23
4.3 ERHALTUNGSMEDIUM HEPG2
.24
4.4 ERHALTUNGSMEDIUM U 937
.24
4.5 BESTIMMUNG DER LEBENDZELLZAHL
.24
5 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 1
.25
5.1 OLIGONUKLEOTIDE
.25
5.1.1 ANTISENSE-PHOSPHOROTHIOAT-OLIGONUKLEOTIDE.25
5.1.2 UNMODIFIZIERTE OLIGONUKLEOTIDE.26
5.2
SYNTHESE UND AUFREINIGUNG UNMODIFLZIERTER OLIGONUKLEOTIDE.28
5.2.1 BUTANOLEXTRAKTION.28
5.2.2 KARTUSCHENREINIGUNG.28
5.3 PLASMID
.30
5.4 REVERSE TRANSKRIPTION
.31
5.5 DNA-AMPLIFIKATION MIT HILFE DER POLYMERASE KETTENREAKTION (PCR)
.32
5.5.1 PCR DER TYP UE-PLA
2.33
5.5.2 PCR DER TYP IV-PLA
2.33
5.5.3 SEMIQUANTITATIVE PCR DER TYP IV-PLA
2.34
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
5.6 AUFREINIGUNG VON PCR-PRODUKTEN
.34
5.7 DNA-PRAEPARATIONEN
.35
5.7.1 PLASMID-MINI-PRAEPARATION.35
5.7.2 PRAEPARATION GROESSERER MENGEN GEREINIGTER PLASMID-DNA.36
5.8 HORIZONTALE AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.36
5.9 DNA-QUANTIFIZIERUNG
.37
5.10 RESTRIKTIONSSPALTUNG VON DNA
. 37
5.11 REINIGUNG VON NUKLEINSAEUREN
.38
5.11.1 PHENOL/CHLOROFORM-EXTRAKTION UND ETHANOL-PRAEZIPITATION.38
5.11.2 DNA SCHNELLAUFREINIGUNG (YYWIZARD-CLEAN UP").39
5.12 DNA-FRAGMENTISOLIERUNG
.39
5.13 SUBKLONIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN
.39
5.13.1 VERKNUEPFUNG VON DNA-ENDEN MIT T4-DNA-LIGASE (LIGATION).40
5.13.2 HERSTELLUNG UND TRANSFORMATION KOMPETENTER BAKTERIEN.40
5.13.3 RETRANSFORMATION VON PLASMID-DNA.41
5.13.4 NACHWEIS POSITIVER KLONE.41
6 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN
II
.42
6.1 RNA-METHODEN
.42
6.1.1 BEHANDLUNG VON GERAETEN UND LOESUNGEN.42
6.1.2 RNA-ISOLIERUNG.43
6.1.3 POLY (A)
+ RNA-ISOLIERUNG AUS HEPG2-ZELLEN.43
6.1.4 RNA-KONZENTRATIONS- UND REINHEITSBESTIMMUNG.44
6.1.5 VERDAU VON DNA IN RNA-PRAEPARATIONEN.44
6.1.6 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE VON RNA.45
6.1.7 NORTHEM-BLOT-HYBRIDISIERUNG.45
6.1.7.1 GELELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON GESAMT-RNA.46
6.1.7.2 TRANSFER UND FIXIERUNG DER RNA AUF NYLONMEMBRAN.46
6.1.7.3 UEBERPRUEFUNG DES TRANSFERS.47
6.1.7.4 HYBRIDISIERUNG.47
6.1.7.5 IMMUNOLOGISCHE DIG-NACHWEISREAKTION.48
6.1.1.6 HERSTELLUNG VON DIG-MARKIERTEN IN VITRO-TRANSKRIPTEN
.49
INHALTSVERZEICHNIS
7 BIOCHEMISCHE METHODEN. 50
7.1 QUANTITATIVE BESTIMMUNG VON PROSTAGLANDIN E
2 (PGE2).50
7.2
QUANTITATIVE BESTIMMUNG VON HUMANER, SYNOVIALER PHOSPHOLIPASE A2
(H-SPLA
2).51
73 QUANTITATIVE BESTIMMUNG VON APOB UND ALBUMIN
.52
8 TIERMODELL.54
8.1 VERSUCHSTIERE
.54
8.2 CARRAGEENINOEDEM ALS AKUTES ENTZUENDUNGSMODELL
.54
8.3 MESSUNG DES PFOTENOEDEMS
.55
8.4 TOPISCHE IN VIVO-BEHANDLUNG MIT ANTISENSE-OLIGONUKLEOTIDEN
.56
85 VERABREICHUNG DER ANTISENSE-OLIGONUKLEOTIDE IN
LIPOSOMEN/OLIGONUKLEOTID-
KOMPLEXEN.56
8.6 STATISTISCHE AUSWERTUNGEN
.57
III
ERGEBNISSE
.58
1 UNTERSUCHUNGEN ZUM NACHWEIS DER TYP II-PLA
2
IN HEPG2-ZELLEN.59
1.1 QUANTITATIVER NACHWEIS VON PGE
2 NACH STIMULATION MIT INTERLEUKIN-6
IN DEN HEPG2-ZELLEN
.59
1.2 QUANTITATIVER NACHWEIS VON H-SPLA
2.60
2 IN VITRO-BEHANDLUNG MIT ANTISENSE-OLIGONUKLEOTIDEN.61
2.1 EINFLUSS DER ANTISENSE-OLIGONUKLEOTIDE AUF DIE PGE
2-SYNTHESE IN HEPG2 -
ZELLEN
.61
2.2
EINFLUSS DER ANTISENSE-OLIGONUKLEOTIDE AUF DIE SPLA2-SYNTHESE IN HEPG2-
ZELLEN NACH 72 UND 96 STUNDEN
.63
2
.3 EFFEKT VON INTERLEUKIN-6 UND ANTISENSE-OLIGONUKLEOTIDEN AUF DIE
SYNTHESE
VON APOLIPOPROTEIN B(100) UND ALBUMIN
.64
3 EINFLUSS VON ANTISENSE-OLIGONUKLEOTIDEN DER TYP IV-PLA
2
IN U 937-ZELLEN 66
4 NACHWEIS DER TYP II-PLA
2
-MRNA.67
4.1 AMPLIFIKATION UND KLONIERUNG DES IN VITRO-TRANSKRIPTIONSVEKTORS
PCMW-SPLA
2.67
4 2 HERSTELLUNG DIG-MARKIERTER SPLA2-RNA-SONDEN.69
INHALTSVERZEICHNIS
4.3 BEEINFLUSSUNG DER YYSTEADY STATE
" KONZENTRATION DER SPLA2-MRNA
DURCH LNTERLEUKIN-6 IN HEPG2-ZELLEN
.70
5 EINFLUSS DER ANTISENSE-OIIGONUKLEOTIDE AUF DIE SPLA
2-MRNA IN HEPG2-
ZELLEN.73
6 ETABLIERUNG EINER SEMIQUANTITATIVEN RT-PCR-TECHNOLOGIE ZUR MESSUNG
DER CPLA
2-MRNA UND GAPDH-MRNA.74
T
7
IN VIVO-WIRKSAMKEIT DER ANTISENSE-OIIGONUKLEOTIDE.77
7.1 WIEDERHOLTE TOPISCHE APPLIKATION DER TYP IL-PLA
2-ANTISENSE-
OLIGONUKLEOTIDE UEBER 4 TAGE
.77
72 ENTZUENDLICHE PFOTENOEDEME NACH EINMALIGER TOPISCHER APPLIKATION DER
TYP II-PLA
2-ANTISENSE-OLIGONUKLEOTIDE.82
73 ENTZUENDLICHE PFOTENOEDEME NACH EINMALIGER TOPISCHER APPLIKATION
STEIGENDER ANTISENSE-OLIGONUKLEOTID-DOSEN.85
7.4 EINFLUSS VON ANTISENSE-OLIGONUKLEOTIDILIPID-KOMPLEXEN AUF DIE HEMMUNG
DES ENTZUENDLICHEN PFOTENOEDEMS
.87
73 HEMMUNG DES CARRAGEENINOEDEMS DURCH DEN SPLA
2-LNHIBITOR
BM 16.2266.89
IV DISKUSSION.
92
1 METHODISCHES ZUR ANTISENSE-STRATEGIE.92
2 BESTIMMUNG DER PLA2-AKTIVITAET.94
3 NACHWEIS DER TYP II-PLA
2 IN HEPG2-ZELLEN UND DER EINFLUSS VON ANTISENSE-
OLIGONUKLEOTIDEN.95
4 NACHWEIS DER SPLA2-MRNA IN HEPG2-ZELLEN UND EINFLUSS DER ANTISENSE-
OIIGONUKLEOTIDE AUF DIE YYSTEADY STATE"-KONZENTRATION DER MRNA.97
5 NACHWEIS DER TYP IV-PLA
2 IN U 937-ZELLEN UND DER EINFLUSS VON
SPEZIFISCHEN ANTISENSE-OLIGONUKLEOTIDEN.99
6 NACHWEIS DER TYP IV-PLA2 IN U 937-ZELLEN UND SEMIQUANTITATIVE
ABSCHAETZUNG DER MRNA NACH BEHANDLUNG MIT DEM ANTISENSE-OLIGONUKLEOTID
.101
INHALTSVERZEICHNIS
7 EINFLUSS DER ANTISENSE-OLIGONUKLEOTIDE
IN VIVO AM BEISPIEL DES AKUTEN
PFOTENOEDEMS DER RATTE.101
8 BETRACHTUNGEN UEBER DAS THERAPEUTISCHE POTENTIAL VON ANTISENSE-
OLIGONUKLEOTIDEN. 105
V
ZUSAMMENFASSUNG.108
ABKUERZUNGEN.HO
LITERATURVERZEICHNIS,
113 |
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