Klonierung und Charakterisierung des negativen Cofaktors 2 der RNA-Polymerase II:
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|---|---|
| Format: | Book |
| Language: | German |
| Published: |
München
Utz, Wiss.
1997
|
| Series: | Biochemie
|
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| Online Access: | Inhaltsverzeichnis |
| Item Description: | Zugl.: München, Univ., Fak. für Chemie und Pharmazie, Diss., 1997 |
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| ISBN: | 3896751778 |
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INHALTSVERZEICHNIS
I
I
NHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG.
.
1
1.1
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
BINDEN
AN
GENETISCHE
KONTROLLELEMENTE.
.
1
1.2
EUKARYONTEN
BESITZEN
VERSCHIEDENE
RNA-POLYMERASEN
.
3
1.3
GENERELLE
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
DER
KLASSE
II
TRANSKRIPTION
.
3
1.4
DIE
ROLLE
DES
TATA-BINDENDEN
PROTEINS
(TBP)
UND
SEINER
ASSOZIIERTEN
FAKTOREN
.
5
1.5
COFAKTOREN
DER
AKTIVIERTEN
TRANSKRIPTION
.
6
1.6
CHROMATIN
UND
TRANSKRIPTION
.
6
1.7
KONTROLLE
DER
BASALEN
TRANSKRIPTION
DURCH
REPRESSOREN
.
7
1.7.1
REPRESSOR-WECHSELWIRKUNGEN
MIT
AKTIVATORPROTEINEN
.
8
1.7.2
REPRESSOR-WECHSELWIRKUNGEN
MIT
COREPRESSOR-PROTEINEN
.
9
1.7.3
REPRESSOR-WECHSELWIRKUNGEN
MIT
GENERELLEN
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
.
9
1.8
AUFGABENSTELLUNG
.
10
2
MATERIAL
.
11
2.1
GERAETE
.
11
2.2
CHEMIKALIEN
UND
BIOCHEMIKALIEN
.
12
2.3
RADIOCHEMIKALIEN
.
15
2.4
ENZYME
.
16
2.5
ANTIKOERPER
.
16
2.6
LOESUNGEN,
PUFFER
UND
KULTURMEDIEN
.
16
2.6.1
LOESUNGEN
UND
PUFFER
.
16
2.6.2
KULTURMEDIEN
.
17
2.7
MOLEKULARBIOLOGISCHE
HILFSMITTEL
.
17
2.8
BAKTERIENSTAEMME
.
18
2.9
DNA
UND
PROTEIN-LAENGENSTANDARDS
.
18
2.9.1
DNA-LAENGENSTANDARDS
.
18
2.9.2
PROTEIN-LAENGENSTANDARDS
.
19
2.10
PLASMIDE
.
20
2.11
OLIGODEOXYRIBONUKLEOTIDE
.
20
2.12
PEPTIDE.
.
21
3
METHODEN
.
21
3.1
METHODEN
DER
PROKARYONTISCHEN
ZELLKULTUR
.
21
3.1.1
ANZUCHT
VON
BAKTERIENKULTUREN
.
21
3.1.2
ANLEGEN
VON
DAUERKULTUREN
.
22
3.2
METHODEN
DER
EUKARYONTISCHEN
ZELLKULTUR.
.
22
3.2.1
ZELLENVERMEHRUNG
IN
SUSPENSION
.
22
3.2.2
ANLEGEN
VON
DAUERKULTUREN
.
23
3.3
DNA
UND
RNA-ARBEITSTECHNIKEN
.
23
3.3.1
BESTIMMUNG
DER
KONZENTRATION
UND
REINHEIT
EINER
NUKLEINSAEURE-PRAEPARATION
.
23
3.3.2
CHLOROPANE-EXTRAKTION
UND
FAELLUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
23
3.3.3
REINIGUNG
VON
DNA
UEBER
GEIFILTRATION
.
24
3.3.4
REINIGUNG
VON
DNA
UEBER
DE52-SAEULEN
.
25
3.3.5
MINIPRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.
COLI
.
25
3.3.6
ISOLIERUNG
VON
RNA
AUS
SAEUGERZELLEN
.
26
3.3.7
POLY(A)*-SELEKTION
.
26
3.3.8
REVERSE
TRANSKRIPTION
VON
POLY(A)*-RNA
.
28
3.3.9
AMPLIFIKATION
VON
DNA
MIT
DER
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
.
28
3.3.10
RESTRIKTIONSHYDROLYSE
VON
DNA
.
29
3.3.11
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.30
3.3.12
ELUTION
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
.
30
II
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.13
REINIGUNG
SYNTHETISCHER
OLIGODEOXYRIBONUKLEOTIDE
.
31
3.3.14
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
OLIGODEOXYRIBONUKLEOTIDEN
AM
5'-ENDE
.
32
3.3.15
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA.
32
3.3.16
AUFFUELLEN
VON
5
'
-UEBERHAENGENDEN
DNA-ENDEN
.
33
3.3.17
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
DOPPELSTRAENGIGER
DNA
MITTELS
"RANDOM-HEXAMER-PRIMING"
.
33
3.3.18
LIGATION
VON
DNA
.
34
3.3.19
HERSTELLUNG
TRANSFORMATIONSKOMPETENTER
.
COLI.
34
3.3.20
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
E.
COLI
.
35
3.3.21
KLONIERUNG
VON
NC2-DERIVATEN
.
35
3.3.22
DNA-SEQUENZIERUNG
.
36
3.3.22.1
DNA-SEQUENZIERUNG
NACH
DEM
DIDEOXY-KETTENABBRUCHVERFAHREN
.
36
3.3.22.2
DNA-SEQUENZIERUNG
DURCH
YYCYCLE
SEQUENCING
"
.
37
3.3.22.3
ANFERTIGUNG
EINES
SEQUENZGELS
UND
DURCHFUEHRUNG
DER
GELELEKTROPHORESE.
38
3.3.23
ISOLIERUNG
UND
IDENTIFIZIERUNG
VON
CDNA-KLONEN
AUS
EINER
XGTL
1-CDNA-GENBANK
.
39
3.3.23.1
VERMEHRUNG
UND
REINIGUNG
VON
X-PHAGEN
.
39
3.3.23.2
DURCHMUSTERN
EINER
GENBANK
.
40
3.3.24
UEBERTRAGUNG
VON
DNA
AUF
NYLONMEMBRANEN
NACH
SOUTHERN
.
42
3
3.25
HYBRIDISIERUNG
FILTERGEBUNDENER
RNA
.
43
3.4
PROTEIN-ARBEITSTECHNIKEN
.
43
3.4.1
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
.
43
3.4.2
SDS-GELELEKTROPHORESE
.
44
3.4.3
FAERBEMETHODEN
FUER
PROTEINE
.
45
3.4.3.1
COOMASSIE-FAERBUNG
.
45
3.4.3.2
SILBERFAERBUNG
.
45
3.4
4
HERSTELLUNG
VON
ZELLKEMEXTRAKTEN
AUS
HELA-ZELLEN
.
46
3.4.5
HETEROLOGE
EXPRESSION
VON
PROTEINEN
IN
E.
COLI
.
48
3.4.6
EXPRESSION
REKOMBINANTER
PROTEINE
IN
WEIZENKEIMEXTRAKTEN
.
50
3.4.7
SAEULENCHROMATOGRAPHIE
.
50
3.4.7.1
PHOSPHOCELLULOSE-CHROMATOGRAPHIE
.
51
3.4.7.2
Q-SEPHAROSE-,
MONO
Q-,
UND
MONO
S-CHROMATOGRAPHIE
.
52
3.4.7.3
GELFILTRATION
.
52
3.4.7.4
YYREVERSED
PHASE
"
-CHROMATOGRAPHIE
.
52
3.4.7.5
NI
2+
-NTA-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
53
3.4.7.6
HEPARIN-CHROMATOGRAPHIE
.
54
3.4.7.7
KOPPLUNG
VON
PROTEINEN
AN
BROMCYAN-AKTIVIERTE
SEPHAROSE
.
54
3.4.7.8
KOVALENTE
KOPPLUNG
VON
ANTIKOERPERN
AN
PROTEIN
A-SAEULEN
.
55
3.4.7.9
AFFINITAETSREINIGUNG
VON
NC2
.
56
3.4.7.10
AFFINITAETSREINIGUNG
VON
TFIID.
56
3.4.7.11
REINIGUNG
VON
NC2SS/DRL
AUS
VACCINIA-INFIZIERTEN
HELA-ZELLEN
.
57
3.5
IMMUNOCHEMISCHE
ARBEITSTECHNIKEN
.
58
3.5.1
HERSTELLUNG
VON
ANTIKOERPERN
IN
KANINCHEN
.
58
3.5.2
ISOLIERUNG
VON
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN
.
58
3.5.3
WESTEM-BLOT
ANALYSE
.
59
3.5.4
WESTEM-BLOT
ANALYSE
IMMOBILISIERTER
PROTEIN-DNA-KOMPLEXE
.
60
3.6
FUNKTIONELLE
ANALYSEN
.
61
3.6.1
FAR-SOUTH-WESTEM-BLOT
ANALYSE
.
61
3.6.2
GELRETARDATIONSANALYSE
(EMSA)
.
62
3.6.3
DNASE
I-FOOTPRINTING
ANALYSE
.
63
3.6.4
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
IN
EINEM
REKONSTITUIERTEN
RNA-POLYMERASE
II
TRANSKRIPTIONSSYSTEM
.
64
3.7
COMPUTERANALYSEN
.
66
INHALTSVERZEICHNIS
III
4
ERGEBNISSE
.
67
4.1
HERSTELLUNG
EINES
IN
VITRO
KLASSE
II
TRANSKRIPTIONSSYSTEMS
.
67
4.1.1
REINIGUNG
DER
GENERELLEN
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
.67
4.1.2
AFFINITAETSREINIGUNG
VON
TFIID
.
68
4.2
IST NC2
IDENTISCH
MIT
DRL?
.
71
4.2.1
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
VON
DRL
AUS
E.
COLI
.
71
4.2.2
DIE
NC2-AKTIVITAET
LAESST
SICH
NICHT
DURCH
DIE
IN
VITRO
PHOSPHORYLIERUNG
VON
REKOMBINANTEN
DRL
REKONSTRUIEREN
.74
4.2.3
EXPRESSION
VON
DRL
IN
VACCINIA-INFIZIERTEN
HELA-ZELLEN
.
75
4.2.4
REINIGUNG
VON
DRL
AUS
VACCINIA-INFIZIERTEN
HELA-ZELLKEMEXTRAKTEN.
76
4.2.5
IMMUNOPRAEZIPITATION
VON
NC2
.
76
4.2.6
MASSENSPEKTROSKOPIE
.
78
4.2.7
DRL
UND
EIN
31
KDA-PROTEIN
COELUIEREN
MIT
DER
NC2-AKTIVITAET
.
79
4.2.8
NC2A
UND
NC2SS
SIND
BESTANDTEILE
DES
TBP-NC2-PROMOTOR-KOMPLEXES
.
79
4.2.9
DIE
AUSBILDUNG
VON
TBP-NC2-PROMOTOR-KOMPLEXEN
HAENGT
VON
DER
ANWESENHEIT
BEIDER
NC2
UNTEREINHEITEN
AB
.
80
4.2.10
AUFREINIGUNG
VON
NC2
UBER
SAEULENCHROMATOGRAPHIE
.
82
4.3
KLONIERUNG
VON
NC2A
.
84
4.3.1
AMINOTERMINALE
SEQUENZIERUNG
VONNC2A
.
84
4.3.2
ISOLIERUNG
DER
CDNA
VON
NC2A
AUS
EINER
X-PHAGENBANK
.
85
4.3.3
NC2A
UND
NC2SS
ZEIGEN
HOMOLOGIE
ZU
DEN
HISTONEN
H2A
UND
H2B
.
87
4.3.4
NC2
IST
GEWEBESPEZIFISCH
UND
ENTWICKLUNGSSPEZIFISCH
REGULIERT
.
88
4.4
FUNKTIONELLE
CHARAKTERISIERUNG
VON
NC2
.
90
4.4.1
KLONIERUNG,
EXPRESSION,
UND
REINIGUNG
VON
NC2-DEIETIONSMUTANTEN
.
90
4.4.2
NC2
REPRIMIERT
DIE
BASALE
TRANSKRIPTION
.
91
4.4.3
NC2
WIRKT
WAEHREND
DER
BILDUNG
DES
PRAEINITIATIONSKOMPLEXES
.
92
4.4.4
REKOMBINANTES
NC2A
UND
NC2SS/DRL
BINDEN
TBP-PROMOTOR-KOMPLEXE
ALS
HETERODIMER
.
93
4.4.5
NC2
MULTIMERISIERT
AUF
LAENGEREN
DNA-FRAGMENTEN
UND
KOMPETITIERT
MIT
TFIIA
UND
TFIIB
.
94
4.4.6
DIE
UNSPEZIFISCHE
DNA-BINDUNG
VON
NC2
WIRD
VON
CASEINKINASE
II
MODULIERT
.
97
4.4.7
NC2
VERAENDERT
DIE
PROMOTORSTRUKTUR
.
99
4.4.8
ZIRKULAERE
PERMUTATIONSANALYSE
VON
PROMOTOR-GEBUNDENEM
NC2
.
99
4.4.9
DNASE
I-FOOTPRINTING
ANALYSE
.
101
4.5
NC2
IST
VOM
MENSCH
BIS
ZUR
HEFE
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
KONSERVIERT
.
104
4.5.1
KLONIERUNG
DER
NC2-UNTEREINHEITEN
VON
HEFE
.
104
4.5.2
VERGLEICH
VON
NC2
AUS
MENSCH
UND
HEFE
.
106
4.5.3
AUSTAUSCHBARKEIT
VON
HEFE
UND
MENSCHLICHEN
NC2-UNTEREINHEITEN
.
106
4.5.4
FUNKTIONELLE
ANALYSE
VON
HEFE
NC2
.
109
5
DISKUSSION
.
111
5.1
ZUSAMMENSETZUNG
DES
REPRESSORS
NC2
.
111
5.2
STRUKTUR-FUNKTIONS-ANALYSE
.
113
5.2.1
NC2
BILDET
QUARTERNAERE
KOMPLEXE
MIT
TBP
AUF
DER
DNA
.
113
5.2.2
FUNKTION
EINZELNER
REGIONEN
DER
NC2-PROTEINE
IN
DER
TRANSKRIPTION
.
114
5.3
REPRESSIONSMECHANISMUS
VON
NC2
.
115
5.4
STRUKTURELLE
HOMOLOGIE
VON
NC2
ZU
DEN
HISTONEN
.
117
5.5
NC2
IST
EVOLUTIONAER
HOCHKONSERVIERT
.
121
5.6
DIE
BIOLOGISCHE
ROLLE
VON
NC2
.
122
5.7
AUSBLICK
.
123
6
ZUSAMMENFASSUNG.
.
125
7
LITERATURVERZEICHNIS
.
127 |
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