Molekularbiologische Charakterisierung der beta-Glukanasen LicA und LicB aus Chlostridium thermocellum:
Saved in:
| Main Author: | |
|---|---|
| Format: | Book |
| Language: | German |
| Published: |
Aachen
Shaker
1997
|
| Edition: | Als Ms. gedr. |
| Series: | Berichte aus der Biologie
|
| Subjects: | |
| Online Access: | Inhaltsverzeichnis |
| Item Description: | Zugl.: München, Techn. Univ., Diss., 1996 |
| Physical Description: | VIII, 189 S. Ill., graph. Darst. |
| ISBN: | 3826522753 |
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I
I
NHALTSVERZEICHNIS
A.
E
INLEITUNG
.
1
B.
M
ATERIAL
UND
M
ETHODEN
.
7
1.
ORGANISMEN
UND
PLASMIDE
.
.
7
2.
ANZUCHT
UND
STAMMHALTUNG
.
10
2.1.
NAEHRMEDIEN
.
10
2.1.1.
MEDIEN
FUER
DIE
ANZUCHT
VON
CLOSTRIDIUM
THERMOCELLUM
.
10
2.1.2.
MEDIEN
FUER
DIE
ANZUCHT
VON
ESCHERICHIA
COLI
UND
BACILLUS
SUBTILIS
.
11
2.1.3.
MEDIUM
FUER
DIE
ANZUCHT
VON
SCHIZOSACCHAROMYCES
POMBE
.
12
2.2.
ANZUCHT
DER
ORGANISMEN
.
12
2.3.
ANZUCHT
BEI
INDUKTION
DES
T5-PROMOTORS
.
12
2.4.
NACHWEIS
VON
GENEXPRESSION
IM
PLATTENTEST
.
13
2.4.1.
NACHWEIS
VON
SS-GALAKTOSIDASE-AKTIVITAET
AUF
X-GAL-PLATTEN
.
13
2.4.2.
NACHWEIS
VON
SS-GHIKANASE-AKTIVITAET
IM
PLATTENTEST
.
13
2.4.3.
NACHWEIS
VON
SS-GLUKANASE-AKTIVITAET
IM
PLATTENTEST
DURCH
MU-GLYKOSIDE
.
14
2.5.
STANUNHALTUNG
.
14
3.
MOLEKULARGENETISCHE
METHODEN.
_
.
_
.
.
15
3.1.
PRAEPARATION
VON
DNA
.
15
3.1.1.
ISOLIERUNG
CHROMOSOMALER
DNA
AUS
C.
THERMOCELLUM.
15
3.1.2.
PLASMIDPRAEPARATION
IM
KLEINEN
MASSSTAB
.
15
3.1.3.
PLASMIDPRAEPARATION
MITTELS
QIAGEN-MINIPREP
.
16
3.2.
REINIGUNG
UND
KONZENTRIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
16
3.2.1.
PHENOLBEHANDLUNG
UND
FAELLUNG
VON
DNA
MIT
ETHANOL
.
16
3.2.2.
REINIGUNG
VON
DNA
MITTELS
WIZARD
MINIPREP
.
16
3.2.3.
REINIGUNG
VON
PCR-AMPLIFIKATEN
.
16
3.3.
PHOTOMETRISCHE
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNA
IN
WAESSRIGER
LOESUNG.
.
17
3.4
ENZYMATISCHE
BEHANDLUNG
VON
DNA
.
17
3.4.1.
SPALTUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN
.
17
3.4.2.
DEPHOSPHORYLIERUNG
LINEARER
DNA-MOLEKUELE
DURCH
ALKALISCHE
PHOSPHATASE
.
17
3.4.3.
LIGATION
VON
DNA-MOLEKUELEN
.
18
3.4.4.
SUKZESSIVE
VERKLEINERUNG
VON
PLASMIDALER
DNA
DURCH
EXONUKLEASE
III
.
18
3.4.5.
DIG-MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
19
3.5.
ELEKTROPHORETISCHE
TRENNUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
UND
GELELUTION
.
19
3.5.1.
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
19
3.5.2.
GELELUTION
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
LMP-AGAROSE
.
20
3.6.
TRANSFER
VON
DNA
AUF
NYLONMEMBRAN
UND
HYBRIDISIERUNG
.
20
3.6.1.
SOUTHEM-BLOT
(RAPID-BLOT)
.
20
3.6.2.
TRANSFER
VON
DNA
AUS
BAKTERIENKOLONIEN
.
20
II
3.6.3.
HYBRIDISIERUNG
MIT
DIG-MARKIERTEN
SONDEN
.
21
3.7.
GEZIELTE
AMPLIFIKATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
HILFE
DER
POLYMERASE
KETTENREAKTION
(PCR)
.
21
3.8.
DNA-SEQUENZIERUNG
NACH
DER
KETTENABBRUCHMETHODE
.
3.8.1.
SEQUENZREAKTION
NACH
DEM
CYCLE-SEQUENCING-VERFAHREN
.
3.8.2.
AUFTRENNUNG
DER
SEQUENZREAKTION
.
3.8.3.
DETEKTION
DER
GETRENNTEN DNA-FRAGMENTE
.
3.8.3.1.
BINDUNG
DES
KONJUGATES
BEI
DIG-MARKIERTEN
PRIMERN
.
3.8.3.2.
BINDUNG
DES
KONJUGATES
BEI
BIOTIN-MARKIERTEN
PRIMERN
.
3.8.3.3.
DETEKTION
.
3.9.
TRANSFER
VON
DNA
IN
E.
COLI
.
3.9.1.
ELEKTROPORATION
VON
E.
COLI
ZELLEN
MIT
PLASMID-DNA
.
3.9.2.
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
PEG/DMSO-ZELLEN
MIT
PLASMID-DNA
.
3.10.
TRANSFORMATION
NATUERLICH
KOMPETENTER
ZELLEN
VON
B.
SUBTILIS
.
4.
PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN
4.1.
ZELLERNTE
UND
HERSTELLUNG
VON
ZELLEXTRAKTEN
.
4.2.
PRAEPARATION
DER
PERIPLASMATISCHEN
FRAKTION
VON
E.
COLI
DURCH
KALTEN
OSMOTISCHEN
SCHOCK
.
4.3.
EINSCHLUSSKOERPER-PRAEPARATION
.
4.4.
HITZEFAELLUNG
VON
MESOPHILEN
WIRTSPROTEIN
.
4.5.
GEWINNUNG
VON
HEFEZELLWAND-MATERIAL
.
4.6.
AUFKONZENTRIERUNG
VON
PROTEINLOESUNGEN
UND
ZELLUEBERSTAENDEN
DURCH
ULTRAFILTRATION
.
4.7.
QUANTITATIVE
PROTEINBESTIMMUNG
.
4.7.1.
COLORIMETRISCHE
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
.
4.7.2.
PROTEINQUANTIFIZIERUNG
VON
GEREINIGTEN
PROTEINEN
MIT
BEKANNTER
PRIMAERSTRUKTUR
.
4.8.
BESTIMMUNG
DER
ENZYMATISCHEN
AKTIVITAET
.
4.8.1.
BESTIMMUNG
DER
GHIKANOLYTISCHEN
AKTIVITAET
IM
DNSA-TEST
.
4.8.2.
HYDROLYSE
VON
ARYL-SS-D-GLYKOSIDEN
.
4.9.
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
4.9.1.
HERSTELLUNG
DER
GELE
.
4.9.2.
PROBENVORBEREITUNG
UND
DURCHFUEHRUNG
DER
ELEKTROPHORESE
.
4.9.3.
COOMASSIE-FAERBUNG
VON
SDS-POLYACRYLAMID-GELEN
.
4.9.4.
NACHWEIS
VON
ENZYMATISCHER
AKTIVITAET
IN
SDS-POLYACRYLAMID-GELEN
.
4.9.4.I.
ABBAU
VON
SS-GLUKANEN
IM
POLYACRYLAMID-GEL
.
4.9.4.2.
UMSETZUNG
VON
MU-SUBSTRATEN
IM
POLYACRYLAMID-GEL
.
4.10.
PROTEINREINIGUNG
DURCH
FPLC
.
4.10.1.
PROBENVORBEREITUNG
UND
PROBENAUFTRAG
.
4.10.2.
ANIONEN-AUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE
.
4.10.3.
HYDROPHOBE
INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE
(HIC)
.
4.10.4.
GROESSENAUSSCHLUSS-CHROMATOGRAPHIE
MITTELS
GELFILTRATION
.
4.10.5.
MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG
MIT
HILFE
DER
GELFILTRATION
.
4.10.6.
HIS-TAG-AFFMITAETS-CHROMATOGRAPHIE
.
T
:G
G
G
G
G
3
$
S
3
G
&
G
G
G
8
8
S
S
S
G
2
OE
S
G
G
G
III
4.11.
CHARAKTERISIERUNG
DER
PROTEINE
.
43
4.11.1.
MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG
.
43
4.11.2.
PH-OPTIMUM
UND
PH-STABILITAET
.
43
4.11.3.
TEMPERATUR-OPTIMUM
UND
TEMPERATUR-STABILITAET
.
43
4.11.4.
SUBSTRATSPEKTRUM
.
43
4.11.5.
CHEMOSTABILITAET
.
44
4.11.6.
KINETISCHE
MESSUNGEN
.
44
4.11.7.
BINDUNGSSTUDIEN
.
44
4.11.8.
BESTIMMUNG
DER
N-TERMINALEN
AMINOSAEURESEQUENZEN
.
45
4.11.9.
DUENNSCHICHT-CHROMATOGRAPHISCHE
ANALYSE
DER
SPALTPRODUKTE
.
45
5.
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
.
46
5.1.
HERSTELLUNG
SPEZIFISCHER
POLYKLONALER
ANTIKOERPER
GEGEN
LICAANAC4
.
46
5.1.1.
IMMUNISIERUNG
VON
KANINCHEN
.
46
5.1.2.
REINIGUNG
DER
ANTI-LICAANAC4-IGG
AUS
DEM
SERUM
.
46
5.2.
WESTEM-BLOT
.
47
5.2.1.
ELEKTROPHORETISCHER
TRANSFER
.
47
5.2.2.
DETEKTION
VON
ANTI-LICAANAC4-IGG
LICA
UND
ANTI-HIS-IGG
.
47
C.
E
RGEBNISSE
.
49
1.
KLONIERUNG
DES
VOLLSTAENDIGEN
ZICA-GENS
AUS
DEM
GENOM
VON
CLOSTRIDIUM
THERMOCELLUM
.
49
1.1.
KARTIERUNG
DER
UMGEBUNG
DES
LICA-GENS
.
49
1.1.1.
SOUTHEM-BLOT-HYBRIDISIERUNG
.
49
1.1.2.
ABGELEITETE
GENKARTE
.
50
1.2.
KLONIERUNG
VON
LICA
.
51
1.2.1.
ANLEGEN
EINER
HINDLLL-GENBANK
UND
EXPRESSIONSSCREENING
.
52
1.2.2.
EINORDNUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
KLONE
MIT
SS-GLUKANASE-AKTIVITAET
.
52
1.3.
SEQUENZIERUNGEN
IM
BEREICH
DES
KLONIERTEN
ZICA-GENS
.
53
2.
OPTIMIERUNG
DER
REKOMBINANTEN
EXPRESSION
IN
E.
COLI
UND
REINIGUNG
DER
SS-GLUKANASEN
LICA
UND
LICB
.
54
2.1.
OPTIMIERUNG
DER
REKOMBINANTEN
EXPRESSION
CLOSTRIDIALER
SS-GLUKANASE-GENE
DURCH
ERHOEHUNG
DER
GENDOSIS
FUER
IN
E.
COLI
SELTENE
TRNAS
.
54
2.1.1.
GEBRAUCH
VON
IN
E.
COLI
SELTEN
VERWENDETEN
CODONS
IN
CLOSTRIDIALEN
GENEN
.
54
2.1.2.
ENTWICKLUNG
VON
HELFER-PLASMIDEN
ZUR
STEIGERUNG
DER
GENDOSIS
LIMITIERENDER
CODONS
.
55
2.1.3.
AUSTESTEN
DER
HELFER-PLASMIDE
BEI
DER
UEBEREXPRESSION
VON
LICA
.
56
2.2.
SAEULENCHROMATOGRAPHISCHE
REINIGUNG
DER
SS-GLUKANASE
LICA
.
60
2.2.1.
EXPRESSION,
HERSTELLUNG
DES
ZELLROHEXTRAKTES
UND
HITZEFAELLUNG
.
60
2.2.2.
CHROMATOGRAPHIE
AN
Q-SEPHAROSE,
PHENYL-SEPHAROSE
UND
GELFILTRATION
.
61
2.2.3.
BILANZIERUNG
DER
REINIGUNG
DES
ENZYMS LICA
AUS
KL112
.
64
2.3.
SAEULENCHROMATOGRAPHISCHE
REINIGUNG
DER
SS-GLUKANASEN
LICB
UND
LICBAC.
66
2.3.1.
CHROMATOGRAPHIE
AN
Q-SEPHAROSE,
PHENYL-SEPHAROSE
UND
GELFILTRATION
.
66
IV
2.3.2.
BILANZIERUNG
DER
REINIGUNG
DES
ENZYMS
LIESS
AUS
KL121
.
68
2.3.3.
REINIGUNG
DES ENZYMS
LICBAC
AUS
KL34
-
BESTIMMUNG
DER
N-TENNINALEN
AMINOSAEUREN
.
70
3.
DELETION
VON
PROTEINBEREICHEN IN
DEN
ENZYMEN
LICA
UND
LIESS
AUS
C.
THERMOCELLUM
UND
IM
ENZYM
LAMA
AUS
T.
NEAPOLITANA
.
73
3.1.
DELETION
VON
N
UND
C-TERMINALEN
DOMAENEN
VON
LICA
SOWIE
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
DER
GENTECHNISCH
VERAENDERTEN
PRODUKTE
.
73
3.1.1.
GERICHTETE
MUTAGENESE
IM
LICA-GEN
DURCH
PCR
.
74
3.1.2.
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
DER
LICA-PRODUKTE
DURCH
HIS-TAG-AFFINITAETS
CHROMATOGRAPHIE
.
76
3.2.
DELETION
DER
C-DOMAENEN
VON
LAMA
AUS
T.
NEAPOLITANA
SOWIE
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
DER
GENTECHNISCH
VERAENDERTEN
PRODUKTE
.
79
3.2.1.
GERICHTETE
MUTAGENESE
IM
ZAMA-GEN
DURCH
PCR
.
79
3.2.2.
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
DER
LAMA-PRODUKTE
DURCH
HIS-TAG-AFFINITAETS
CHROMATOGRAPHIE
.
81
3.3.
DELETION
DER
CELLULOSOMEN-BINDUNGS-DOMAENE
VON
LIESS
SOWIE
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
DER
GENTECHNISCH
VERAENDERTEN
PRODUKTE
.
83
3.3.1.
GERICHTETE
MUTAGENESE
IM
LICB-GEN
DURCH
PCR
.
83
3.3.2.
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
DER
LICSS-PRODUKTE
DURCH
HIS-TAG-AFFINITAETS
CHROMATOGRAPHIE
.
84
4.
VERGLEICHENDE
CHARAKTERISIERUNG
DER
REKOMBINANT
ERZEUGTEN
DELETIONSPROTEINE
.86
4.1.
VERGLEICH
DER
ENZYMEIGENSCHAFTEN
VON
LICA
UND
LICAANAC4
.
86
4.2.
VERGLEICH
DER
GEREINIGTEN
LICA-DELETIONSPROTEINE
.
93
4.3.
VERGLEICH
DER
PROTEINE
LAMA,
LAMAANAC
UND
LAMAANAC-CL(LICA)
.
96
4.4.
BINDUNGSSTUDIEN
AN
CURDLAN,
AVICEL
UND
SAEUREGEQUOLLENEM
AVICEL
.
99
4.5.
VERGLEICH
DER
GEREINIGTEN
LICB-PROTEINE
.102
5.
IMMUNOLOGISCHE STUDIEN
ZUR
EXPRESSION
UND
LOKALISATION
DER
SS-GLUKANASE
LICA
IN
C.
THERMOCELLUM
UND
ANREICHERUNG
DES
NATIVEN
ENZYMS
.
108
5.1.
ERZEUGUNG
UND
REINIGUNG
VON
POLYKLONALEN
ANTIKOERPERN
GEGEN
DAS ENZYM
LICAANAC4
.
108
5.2.
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
DES
ENZYMS
LICA
IM
ZELLEXTRAKT
UND
IM
ZELLFREIEN
KULTUR-UEBERSTAND
VON
C.
THERMOCELLUM
.
110
5.2.1.
EXPRESSION
DER
LAMINARINASE
LICA
IN
C.
THERMOCELLUM
IN
ABHAENGIGKEIT
VOM
WACHSTUMSSUBSTRAT
.
110
5.2.2.
EXPRESSION
DER
LAMINARINASE
LICA
IN
C.
THERMOCELLUM
IN
ABHAENGIGKEIT
VON
DER
WACHSTUMSPHASE
.113
5.3.
FRAKTIONIERUNG
VON
ZELLOBERFLAECHENPROTEINEN
AUS
C.
THERMOCELLUM
UND
NACHWEIS
VON
LICA
IN
DER
OBERFLAECHENASSOZIIERTEN
FRAKTION
.115
5.4.
INTERAKTION
DER
SLH-DOMAENEN
VON
LICA
MIT
PROTEINEN
AUS
C.
THERMOCELLUM
.
118
5.5.
SAEULENCHROMATOGRAPHISCHE REINIGUNG
VON
LICA
AUS
C.
THERMOCELLUM
.
120
5.6.
VERGLEICHENDE
CHARAKTERISIERUNG
VON
LICA
AUS
C.
THERMOCELLUM
UND
DES
REKOMBINANT
GEREINIGTEN
LICA
.123
V
D.
D
ISKUSSION
.
125
1.
GENSTRUKTUR
VON
HCA
UND
HCB
AUS
CLOSTRIDIUM
THERMOCELLUM
_
.
_
125
2.
STEIGERUNG
DER
HETEROLOGEN
EXPRESSION
CLOSTRIDIALER
GENE
IN
.
COLI
DURCH
ERHOEHUNG
DER
GENDOSIS
VON
ILEX
.
130
3.
CHARAKTERISIERUNG
DER
GEREINIGTEN
LICB-PROTEINE
-
EINFLUSS
DER
CSBD
AUF
DIE
ENZYMEIGENSCHAFTEN
.
133
4.
CHARAKTERISIERUNG
DER
GEREINIGTEN
LICA
UND
LAMA-PROTEINE
-
EINFLUSS
DER
C-DOMAENEN
AUF
DIE
ENZYMEIGENSCHAFTEN
.
136
5.
EXPRESSION
UND
LOKALISATION
DES
ENZYMS
LICA
IN
C.
THERMOCELLUM
-
BEDEUTUNG
DER
SLH-DOMAENEN
.
141
E.
Z
USAMMENFASSUNG
.
147
F.
L
ITERATURVERZEICHNIS
.
149
G.
A
NHANG
.
163
1.
NUKLEINSAEURESEQUENZ
DES
ITCA-GENS
UND
DESSEN
UMGEBUNG
.
163
2.
DOMAENENSTRUKTUR
VON
LICA.
_
167
3.
PCR-KONSTRUKTE
LICA
.
169
4.
PCR-KONSTRUKTE
LAMA
.
172
5.
PCR-KONSTRUKTE
LICB
.
173
6.
KLONIERUNG,
SEQUENZIERUNG
UND
EXPRESSION
EINES
CHITINASE-GENS
AUS
C.
THERMOCELLUM
.
177
6.1.
KLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
DES
VOLLSTAENDIGEN
CHITINASE-GENS
.
177
6.2.
ANALYSE
DER
DNA-SEQUENZ
DOWNSTREAM
VON
CELA
.
180
6.3.
ANALYSE
DER
ABGELEITETEN
AMINOSAEURE-SEQUENZEN
.
181
6.4.
REKOMBINANTE
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
DER
CHITINASE
CHIA
.
186
6.5.
BEDEUTUNG
DER
CHITINASE
CHIA
.188 |
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