Strukturelle und funktionelle Charakterisierung von Annexin II:
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1995
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INHALTSVERZEICHNIS
-I
1.
EINLEITUNG
.
1
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
13
2.1.
CHEMIKALIEN
UND
KITS
.
13
2.2.
RADIOCHEMIKALIEN
.
13
2.3.
ANTIKOERPER
.
13
2.4.
BAKTERIENSTAEMME
.
13
2.4.1.
GLYCERINKULTUREN
.
13
2.4.2.
WACHSTUMSMESSUNG
.
14
2.4.3.
NAEHRMEDIEN
.
14
2.5.
VEKTOREN
UND
PLASMIDE
.
14
2.6.
ZELLINIEN
.
15
2.7.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
15
2.7.1.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
15
2.7.2.
PHENOLEXTRAKTION
.
:
.
16
2.7.3.
FAELLUNG
VON
DNA
BZW.
RNA
.
16
2.7.4.
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
16
2.7.4.1.
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
PRAEPARATIVEN
AGAROSE
GELEN
.
17
2.7.5.
KOMPETENTE
ZELLEN
UND
TRANSFORMATION
IN
E
COLI
.
17
2.7.6.
ISOLIERUNG
VON
PLASMIDEN
AUS
E
COLI
(ALKALISCHE
LYSE)
.
18
2.7.6.1.
ANALYTISCHE
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
.
18
2.7.6.2.
PRAEPARATIVE
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
.
19
2.7.7.
SPALTUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
19
2.7.8.
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA-ENDEN
.
20
2.7.9.
LIGATION
VON
DNA-ENDEN
.
20
2.7.10.
ANALYTISCHE
M13-ISOLIERUNG
AUS
E.
COLI
.
21
2.7.11.
PRAEPARATIVE
M13-ISOLIERUNG
AUS
E
COLI
.
21
2.7.12.
OLIGONUKLEOTIDE
.
22
2.7.12.1.
SYNTHESE
UND
AUFBEREITUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
.
22
2.7.12.2.
5'-PHOSPHORYLIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
.
22
2.7.13.
ORTSGERICHTETE
MUTAGENESE
(KUNKEL,
1985)
.
23
2.7.14.
DNA-SEQUENZIERUNG
(SANGER,
1977)
.
23
2.7.15.
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR,
SAIKI
ET
AL.,
1988)
.
24
2.8.
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
.
25
2.8.1.
ISOLIERUNG
VON
REKOMBINANTEM
ANNEXIN
II
AUS
E.
COLI
.
25
2.8.2.
ISOLIERUNG
VON
REKOMBINANTEM
ANNEXIN
II
AUS
INSEKTENZELLEN
.
27
2.8.3.
ISOLIERUNG
VON
ANNEXIN
II
UND
P11
AUS
SCHWEIN
.
28
INHALTSVERZEICHNIS
-II
2.8.4.
LIMITIERTE
PROTEOLYSE
VON
ANNEXIN
II
.
28
2.8.5.
GELFILTRATION
IN
NATIVEM
PUFFER
.
28
2.8.6.
PHOSPHOLIPID-BINDUNG
.
29
2.8.7.
IN
V/'TRO-PHOSPHORYLIERUNG
.
30
2.8.8.
SDS-POLYACRYLAMID
GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
30
2.8.9.
WESTERN
BLOT-ANALYSE
.
31
2.8.10.
IMMUNZYTOCHEMIE
.
32
2.8.11.
P1
1
-BINDUNG
AN
IMMOBILISIERTES
ANNEXIN
II
(YYOVERLAY
"
)
.
33
2.8.12.
FAELLUNG
VON
PROTEINEN
MIT
CHLOROFORM/METHANOL
(WESSEL
UND
FLUEGGE,
1984)
.
33
2.8.13.
PROTEINBESTIMMUNG
.
33
2.8.13.1.
PHOTOMETRISCHE
PROTEINBESTIMMUNG
.
33
2.8.13.2.
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
BRADFORD
(1976)
.
34
2.8.14.
ISOLIERUNG
VON
ENDOSOMEN
AUS
BHK-ZELLEN
.
34
2.8.14.1.
HRP-MARKIERUNG
VON
ENDOSOMEN
.
34
2.8.14.2.
FRAKTIONIERUNG
VON
ENDOSOMEN
AUS
DEM
PNS
(YYPOST
NUCLEAR
SUPERNATANT
"
)
.
34
2.8.14.3.
HRP-BESTIMMUNG
.
36
2.8.14.4.
LATENZMESSUNG
DES
PNS
.
36
2.9.
ZELLKULTUR
.
36
2.9.1.
PASSAGIEREN
VON
ZELLEN
.
36
2.9.2.
EINFRIEREN
UND
AUFTAUEN
VON
ZELLINIEN
.
37
2.9.3.
STIMULIERTE
EXOZYTOSE
.
37
2.9.3.1.
DSSH-FAERBUNG
.
38
2.9.4.
DIFFERENZIERUNG
VON
PC12-ZELLEN
.
38
2.9.5.
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
VON
EUKARYOTISCHEN
ZELLEN
.
38
2.9.6.
IMMUNFLUORESZENZ
.
39
2.9.7.
SERIELLE
EXTRAKTION
VON
HELA-ZELLEN
.
40
2.9.8.
AKTINFAERBUNG
.
41
2.9.9.
CYTOCHALASIN
B
.
42
2.9.10.
COLCEMID
.
42
2.9.11.
BACULOVIRUS
.
42
2.9.11.1.
INSEKTENZELLEN-KULTIVIERUNG
.
42
2.9.11.2.
TITERBESTIMMUNG
VON
BACULOVIREN
.
42
2.9.11.3.
KOTRANSFEKTION
VON
PLASMID
UND
LINEARISIERTER
BACULOVIRUS-DNA
.
42
2.9.11.4.
EXPRESSION
VON
REKOMBINANTEM
ANNEXIN
II
IN
SF
9-ZELLEN
.
43
INHALTSVERZEICHNIS
-III
3.
ERGEBNISSE
.
44
3.1.
STRUKTURELLE
CHARAKTERISIERUNG
VON
CA
2+
-SSINDUNGSSTELLEN
IM
ANNEXIN
II
.
44
3.2.
CHARAKTERISIERUNG
VON
ZWEI
CA
2+
-BINDUNGSSTELLEN
IM
1.
SEGMENT
.
47
3.2.1.
HERSTELLUNG
UND
AUFREINIGUNG
DER
MUTANTEN
IM
1.
SEGMENT
.
48
3.2.1.1.
TM-MUTANTE
.
48
3.2.2.
CHARAKTERISIERUNG
DER
TM-MUTANTE
.
50
3.2.2.1.
CHYMOTRYPSIN-VERDAU
.
50
3.2.2.2.
TRYPSIN-VERDAU
.
50
3.2.2.3.
WESTERN
BLOT-ANALYSE
.
51
3.2.2.4.
CA
2+
-ABHAENGIGE
BINDUNG
AN
LIPOSOMEN
.
51
3.2.3.
CHARAKTERISIERUNG
DER
TCM-MUTANTE
.
53
3.2.3.1
.
CHYMOTRYPSIN-VERDAU
.
53
3.2.3.2.
TRYPSIN-VERDAU
.
53
3.2.3.3.
WESTERN
BLOT-ANALYSE
.
53
3.2.3.4.
CA
2+
-ABHAENGIGE
BINDUNG
AN
LIPOSOMEN
.
53
3.3.
KONSTRUKTION
EINER
TYP
II
CA
2+
-BINDUNGSSTELLE
IM
1.
SEGMENT
(+1
-MUTANTE)
.
54
3.3.1.
HERSTELLUNG
UND
AUFREINIGUNG
DER
+1-MUTANTE
.
54
3.3.2.
LIPOSOMENBINDUNG
DER
+1-MUTANTE
.
55
3.4.
CHIMAERE
AUS
ANNEXIN
II
UND
ANNEXIN
V
.
55
3.5.
BACULOVIRUS-EXPRESSION
.
56
3.5.1.
AUFREINIGUNG
DER
ANNEXIN
IL-DERIVATE
AUS
SF
9-ZELLEN
.
57
3.5.2.
P1
1
-BINDUNG
AN
IMMOBILISIERTES
ANNEXIN
II
.
59
3.5.3.
KARTIERUNG
VON
PHOSPHORYLIERUNGSSTELLEN
IN
DER
N-TERMINALEN
DOMAENE
DES
ANNEXIN
II
.
60
3.5.3.1.
PKC
PHOSPHORYLIERT
2
SERINRESTE
IN
DER
ANNEXIN
II
KOPF
DOMAENE
.
62
3.6.
CHARAKTERISIERUNG
VON
LIGANDEN-BINDUNGSSTELLEN
IM
ANNEXIN
II
IN
VIVO
.
65
3.6.1.
BEDEUTUNG
DER
CA
2+
-BINDUNGSSTELLEN
FUER
DIE
INTRAZELLULAERE
VERTEILUNG
DES
ANNEXIN
II
IN
HELA-ZELLEN
.
65
3.6.1.1.
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
VON
HELA-ZELLEN
.
65
3.6.1.2.
INTRAZELLULAERE
VERTEILUNG
DER
ANNEXIN
IL-DERIVATE
MIT
DEFEKTEN
CA
2+
-BINDUNGSSTELLEN
(WESTERN
BLOT-ANALYSE)
.
67
3.6.1.3.
INTRAZELLULAERE
VERTEILUNG
DER
ANNEXIN
IL-DERIVATE
MIT
DEFEKTEN
CA
2+
-BINDUNGSSTELLEN
(IMMUNFLUORESZENZ-ANALYSE)
.
69
INHALTSVERZEICHNIS
-IV
3.6.2.
GEZIELTE
INTRAZELLULAERE
AGGREGATION
DES
ANNEXIN
IL-P1
1
KOMPLEXES
.
71
3.6.2.1.
ANNEXIN
II
UND
DIE
DIFFERENZIERUNG
VON
PC12-ZELLEN
.
73
3.6.2.1.1.
EXPRESSION
DER
TRANS-DOMINANTEN
MUTANTE
IN
PC12-ZELLEN
.
73
3.6.3.
MESSUNG
DER
EXOZYTOSE
AN
PC12
UND
CHROMAFFINZELLEN
.
76
3.6.3.1.
DIE
ROLLE
VON
ANNEXIN
II
AN
EXOZYTOTISCHEN
PROZESSEN
IN
PC12-ZELLEN
.
77
3.6.3.2.
DIE
BEDEUTUNG
DES
ANNEXIN
II
BEI
EXOZYTOTISCHEN
PROZESSEN
IN
CHROMAFFINZELLEN
DES
RINDES
.
79
3.6.4.
CHARAKTERISIERUNG
DER
ANNEXIN
IL-BINDUNG
AN
ENDOSOMEN
.
81
3.6.4.1.
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
VON
ANNEXIN
II
PCMV
5-KONSTRUKTEN
IN
BHK-ZELLEN
.
81
3.6.4.2.
ISOLIERUNG
VON
ENDOSOMEN
AUS
BHK-ZELLEN
.
83
3.6.4.3.
VERTEILUNG
VON
ANNEXIN
IL-DERIVATEN
AUF
VERSCHIEDENE
MEMBRAN-FRAKTIONEN
.
85
3.6.4.4.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
NATUR
DER
ANNEXIN
LL-LNTERAKTION
MIT
ENDOSOMEN
.
88
4.
DISKUSSION
.
90
4.1.
ANNEXIN
II
UND
CA
2+
-BINDUNG
.
90
4.1.1.
LOKALISIERUNG
DER
TYP
III
BINDUNGSSTELLEN
.
90
4.1.2.
KONSTRUKTION
EINER
ZUSAETZLICHEN
TYP
II
CA
2+
-BINDUNGSSTELLE
.
94
4.2.
ANNEXIN
IL/ANNEXIN
V-CHIMAERE
.
94
4.3.
DIE
ROLLE
VON
CA
2+
-BINDUNGSSTELLEN
FUER
DIE
INTRAZELLULAERE
VERTEILUNG
DES
ANNEXIN
II
IN
HELA-ZELLEN
.
96
4.4.
CHARAKTERISIERUNG
DER
ANNEXIN
IL-BINDUNG
AN
ENDOSOMEN
.
97
4.5.
BACULOVIRUS-SYSTEM
.
101
4.5.1.
KARTIERUNG
VON
PKC-PHOSPHORYLIERUNGSSTELLEN
IM
ANNEXIN
II
.
102
4.6.
IN
VIVO
ANSAETZE:
PC12
UND
CHROMAFFINZELLEN
.
104
4.6.1.
NGF-INDUZIERTE
DIFFERENZIERUNG
VON
PC12-ZELLEN
.
104
4.6.2.
EXOZYTOSE:
PC1
2
BZW.
CHROMAFFINZELLEN
.
105
5.
ZUSAMMENFASSUNG
.
110
6.
ANHANG
.
112
6.1.
ABKUERZUNGEN
.
112
6.2
ANNEXIN
II
CDNA-SEQUENZ
.
114
6.3.
OLIGONUKLEOTIDE
.
115
7.
LITERATURVERZEICHNIS
.
116 |
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