Durchflußzytophotometrische Mehrparameteranalyse zur Erfassung und Quantifizierung von Wachstumsfaktor-Rezeptorregulation beim humanen Harnblasenkarzinom:
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INHALT
1
I EINLEITUNG
_1
1 BEDEUTUNG DER DURCHFLUSSZYTOPHOTOMETRISCHEN MEHRPARAMETERANALYSE IN DAR
ONKOLOGIE 1
2 BEDEUTUNG DES EGFR-GEHALTES HUMANER HAMBLASENTUMOREN 2
3 ZIELSETZUNG 3
S
D THEORETISCHE GRUNDLAGEN
_6
1 DURCHFLUSSZYTOPHOTOMETRISCHE MESSTECHNIK UND DATENINTERPRETATION 6
1.1 PRINZIP DA* DURCHFLUSSZYTOPHOTOMETRISCHEN MESSTECHNIK 6
1.2 AUSWERTUNG DURCHFLUSSZYTOPHOTOMETRISCHER DATEN 8
2 ZELLKULTURTECHNIKEN 11
2.1 ZWEIDIMENSIONALE ZELLKULTUREN (ML) 11
2.2 DREIDIMENSIONALE ZELLKULTUREN (MC§) ~ 11
FFL MATERIAL UND METHODEN
_12
1 ZELLKULTUR 12
1.1 VERWENDETE ZELLINIEN 12
1.1.1 DIE HAMBLASENKARZINOMZELLINIE RT4 "12
1.1.2 DIE HAMBLASENKARZINOMZELLINIE J82 12
1.1.3 DIE CERVIXKARZMOMZELLINIE CASKI 12
1.1.4 DIE FIBROBLASTENZELLINIE NI 12
1.2 METHODEN DER ZELLKULTIVIERUNG 12
1.2.1 KULTIVIERUNG UND ERNTE VON MONOLAYEM (ML) 12
1.2.2 KULTIVIERUNG UND ERNTE VON SPHAEROIDEN (MCS) 13
1.2.3 ZQCHTUNG UND ERNTE VON KOKULTUREN (KOKU) 13
1.3 MATMAL UND GERAETE FUER DIE ZELLKULTUR 13
2 DURCHFLUSSZYTOPHOTOMETRISCHE UNTERSUCHUNGEN 14
2.1 ZELLPRAEPARATIONEN UND FAERBEPROTOKOLLE 14
2.1.1 PROTOKOLL DER DOPPELMARKIERUNG: MEMBRANSTAENDIGER REZEPTOR / DNA 14
2.1.2 PROTOKOLL FUER DIE ERMITTLUNG VON GERAETEEINSTELLUNGEN FUER EINE
DREIFARBENANALYSE 14
2.1.3 PROTOKOLL DER DREIFACHMARKIERUNG: EGFR, URO5 UND DNA 15
2.1.4 PROTOKOLL FUER DEN NACHWEIS DER REZEPTORAKTIVIERUNG 15
2.1.5 PRAEPARATION, EGFR/URO5-MARKIERUNG UND DNA-FAERBUNG
VON PRIMAEREN HAMBLASENTUMOREN 16
2.2 EGFR-QUANTIFIZIERUNG UND DNA-ANALYSE 16
2.3 MATERIAL UND GERAETE FUER DIE DURCHFLUSSZYTOPHOTOMETRIE 17
2.4 REAGENZIEN FUER DEN NACHWEIS INTRAZELLULAERER ANTIGENE 18
3 IMMUNHISTOCHEMISCHE EGFR-DARSTELLUNG AN PRIMAEREN HAMBLASENTUMOREN 18
4 MOLEKULARBIOLOGISCHE UND PROTEINCHEMISCHE METHODEN ZUR UNTERSUCHUNG
ZWEIER
UNTERSCHIEDLICH DIFFERENZIERTER HAMBLASENTUMORZELLINIEN
19
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/950082066
INHALT
U
4.1
WESTEM-BLOT
ANALYSEN, IMMUNPRAEZIPITATIONEN UND
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 19
4.1.1 PROTEINISOLIERUNG FUER
WESTEM-BLOTS
19
4.1.2 PROTEINKONZENTRATIONSBESTIMMUNG NACH BRADFORD 19
4.1.3 PROTEINTRANSFER
(WESTEM-BLOT)
20
4.1.4
WESTEM-BLOT
ENTWICKLUNG 20
4.2 IMMUNPRAEZIPITATION ' 20
4.2.1 BIOTINYLIERUNG VON OBERFLAECHENPROTEINEN, ZELLYSE UND
SOLUBILISIERUNG VON MEMBRANPROTEINEN 21
4.2.2 IMMUNPRAEZIPITATION 21
4.3 GELELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON PROTEINEN (SDS-PAGE) 21
4.4 REAGENZIEN UND GERAETE FUER DIE SDS-PAGE,
WESTEM-BLOTS
UND IMMUNPRAEZIPITATIONEN 22
4.4.1
IMMUNCHEMISCHE REAGENZIEN, PUFFER UND LOESUNGEN ^ 22
4.5 DIE REVERSE TRANSKRIPTION UND DIE POLYMERASE KETTENREAKTIONTRT-PCR)
23
4.5.1 RNA-ISOLATION FUER DIE RT-PCR 23
4.5.2 DIE REVERSE TRANSKRIPTION 24
4.5.3 DIE POLYMERASE KETTENREAKTION (PCR) 24
4.6 MATERIAL UND GERAETE FUER DIE RNA-ISOLIERUNG UND DIE RT-PCR 24
5 MATERIAL UND GERAETE ALLGEMEIN 25
IV ERGEBNISSE
_26
1 ETABLIERUNG DER DNA-DREIPARAMETERANALYSE AM
EIN-LASER-DURCHFLUSSZYTOPHOTOMETER FACSCAN 26
1.1 AUFNAHME DER EMISSIONSSPEKTREN VERWENDETER FLUORESZENZFARBSTOFFE 26
1.2 ETABLIERUNG EINES KOMPENSATIONSPROTOKOLL 27
1.3 F ARBSTOFFKOMBINATION FITC, R-PE UND 7-AAD 28
1.4 FARBSTOFFKOMBINATION SYTO-13, R-PE UND QR 28
1.5 FARBSTOFFKOMBINATION FITC, R-PE UND PI 29
2 BESTIMMUNG DES EGFR-GEHALTES UND DER SPF VON RT4 UND J82
IN ABHAENGIGKEIT UNTERSCHIEDLICHER KULTURBEDINGUNGEN 3 3
3 UNTERSUCHUNG VON PRIMAEREN HARNBLASENTUMOREN MITTELS
FLUSSZYTOMETRISCHER DREIFARBENANALYSE UND IMMUNCHEMISCHER TECHNIKEN 36
3.1 FLUSSZYTOMETRISCHE EGFR-QUANTIFIZIERUNG UND DNA-ANALYSE 36
3.2 IMMUNHISTOCHEMISCHE EGFR-DARSTELLUNG 37
4 UNTERSUCHUNGEN ZUR WACHSTUMSREGULATION VON RT4 UND J82 39
4.1 UNTERSUCHUNGEN ZUR REZEPTORAKTIVIERUNG NACH STIMULATION MIT EGF 40
4.1.1 SPEZIFITAETSNACHWEIS
DER
FLUSSZYTOMETRISCHEN PHOSPHOTYROSIN-FAERBUNG 3 9
4.2 UNTERSUCHUNGEN ZUR EXPRESSION VON REZEPTOREN AUS DER EGFR-FAMILIE 40
4.2.1 FLUSSZYTOMETRISCHER NACHWEIS VON REZEPTOREN AUS DER EGFR-FAMILIE 40
4.3 IFESTERA-AE/ORNACHWEIS VON REZEPTOREN AUS DER EGFR-FAMILIE 40
INHALT M
4.4 NACHWEIS DER TRANSKRIPTION VON C-ERBB4 MITTELS RT-PCR 40
4.5 UNTERSUCHUNGEN ZUR EGFR/C-ERBB4-INTERAKTION MITTELS
IMMUNPRAEZIPITATION 41
4.5.1 F LUSSZYTOMETRISCHER NACHWEIS VON TGFA AUF PROTEINEBENE 43
4.5.2 NACHWEIS DER TRANSKRIPTION VON TGFA MITTELS RT-PCR 43
4.5.3 UNTERSUCHUNGEN ZUR EXPRESSION ZYTOSKELETTALER PROTEINE 45
V DISKUSSION
_!_46
1 ETABLIERUNG DER DNA-DREIPARAMETERANALYSE AN DEM
EIN-LASER-DURCHFLUSSZYTOPHOTOMETER FACSCAN 46
1.2 FARBSTOFFKOMBINATION FITC, R-PE UND 7-AAD 46
1.3 FARBSTOFFKOMBINATION FITC, PI UND QR 46
1.4 FARBSTOFFKOMBINATION SYTO-13, R-PE UND QR 47
1.1 FARBSTOFFKOMBINATION FITC, R-PE, PI _ 47
2 ANWENDUNG DER DNA-DREIPARAMETERFAERBUNG ZUR EGFR-QUANTIFIZTERUNG
UND DNA-ANALYSE AN
IN VITRO
KOKULTUREN 49
3 UNTERSUCHUNGEN VON PRIMAEREN HAMBLASENTUMOREN 50
3.1 FLUSSZYTOMETRISCHE EGFR-QUANTIFIZIERUNG UND DNA-ANALYSE 50
3.2 IMMUNHISTOCHEMISCHE DARSTELLUNG DES EGFR 52
4 UNTERSUCHUNGEN ZUR WACHSTUMSREGULATION VON RT4 UND J82 53
4.1 (REZEPTOR-)AKTIVIERUNG NACH STIMULATION MIT EGF 53
4.2 AUTOKRINE WACHSTUMSSTIMULATION 54
4.3 EXPRESSION VON REZEPTOREN AUS DER EGFR-FAMILIE 55
4.4 EXPRESSION ZYTOSKELETTALER PROTEINE 56
VI ZUSAMMENFASSUNG
_57
1 DURCHFLUSSZYTOPHOTOMETRISCHE DNA-DREIPARAMETERANALYSE 57
2 WACHSTUMSREGULATION HUMANER HAMBLASENTUMORZELLINIEN 57
VII ANHANG
_59
1 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 59
1.1 ABKUERZUNGEN ALLGEMEIN 59
1.2 PHYSIKALISCHE UND CHEMISCHE EINHEITEN 59
1.3 ABKUERZUNGEN IM INDEX 59
2 DATEN DER FLUSSZYTOMETRISCHEN EGFR-QUANTIFIZIERUNG UND DNA-ANALYSE
PRIMAERER HAMBLASENTUMORE 60
VIII LITERATURVERZEICHNIS
_61
IX INDEX
_ 70 |
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