Reinigung und Charakterisierung der Gallensäuren Beta-Glucosidase aus Humanleber:
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1996
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V
INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
.
1
2
MATERIAL
UND
METHODEN
.
5
2.1
ALLGEMEINE
METHODEN,
CHEMIKALIEN
UND
UNTERSUCHUNGSMATERIAL
.
5
2.1.1
METHODEN
.
5
2.1.2
CHEMIKALIEN
.
6
2.1.3
UNTERSUCHUNGSMATERIAL
.
8
2.2
ENZYMTESTS
.
9
2.2.1
VORINKUBATIONSANSAETZE
ZUR
STEIGERUNG
DER
SS-GLUCOSIDASEAKTIVITAET
.
9
2.2.2
BESTIMMUNG
DER
SS-GLUCOSIDASEAKTIVITAET
GEGENUEBER
LITHOCHOLSAEURE
GLUCOSID
.
10
2.2.2.1
STANDARDTEST
.
10
2.2.2.1
LITHOCHOLSAEUREGLUCOSIDASETEST
NACH
PROBENAKTIVIERUNG
BZW.
-REAKTIVIERUNG
.
10
2.2.3
BESTIMMUNG
DER
SS-GLUCOSIDASEAKTIVITAET
GEGENUEBER
CHENODESOXYCHOL
SAEUREGLUCOSID
.
11
2.2.4
BESTIMMUNG
DER
SS-GLUCOSIDASEAKTIVITAET
GEGENUEBER
HYODESOXYCHOL
SAEUREGLUCOSID
.
11
2.2.5
BESTIMMUNG
DER
SS-GLUCOSIDASEAKTIVITAET
GEGENUEBER
SS-OCTYLGLUCOSID
.
11
2.2.6
BESTIMMUNG
DER
SS-GLUCOSIDASEAKTIVITAET
GEGENUEBER
GLUCOCEREBROSID
.
12
2.2.7
BESTIMMUNG
DER
SS-GLUCOSIDASEAKTIVITAET
GEGENUEBER
METHYLUMBELLIFERYL-
GLUCOSID
.
12
2.3
PROTEINGEHALTSBESTIMMUNG
.
13
2.3.1
MICRO
BCA-TEST
VON
BIO-RAD
.
13
2.3.2
DENSITOMETRIE
.
13
2.4
REINIGUNG
DER
GALLENSAEUREN
SS-GLUCOSIDASE
.
14
2.4.1
PRAEPARATION
VON
HUMANLEBERMIKROSOMEN
.
16
2.4.1.1
LOESUNGEN
UND
PUFFER
.
16
2.4.1.2
PRAEPARATION
.
16
2.4.2
SOLUBILISIERUNG
DER
GALLENSAEUREN
SS-GLUCOSIDASE
AUS
MIKROSOMEN
.
16
2.4.3
POLYETHYLENGLYKOL-FRAKTIONIERUNG
.
17
VI
2.4.3.1
LOESUNGEN
UND
PUFFER
.
17
2.4.3.2
FAELLUNG
.
19
2.4.4
ANIONENAUSTAUSCHERCHROMATOGRAPHIE
AN
DEAE-TRISACRYL
M-GEL
.
19
2.4.4.1
VERSUCHSAUFBAU,
GELMATERIAL
UND
PUFFERLOESUNGEN
.
19
2.4.4.2
CHROMATOGRAPHIE
.
20
2.4.5
ANIONENAUSTAUSCHERCHROMATOGRAPHIE
AN
EINER
FPLC-MONO
Q-SAEULE
.20
2.4.5.1
VERSUCHSAUFBAU,
GELMATERIAL
UND
PUFFERLOESUNGEN
.
20
2.4.5.2
CHROMATOGRAPHIE
.
21
2.4.6
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
AN
9-CARBOXYNONYL-DNM-AH-SEPHAROSE
.
21
2.4.6.1
GELMATERIAL,
LOESUNGEN
UND
PUFFER
.
22
2.4.6.2
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
22
2.4.7
CHROMATOFOKUSSIERUNG
AN
EINER
FPLC-MONO
P-SAEULE
.
23
2.4.7.1
VERSUCHSAUFBAU,
GELMATERIAL
UND
PUFFERLOESUNGEN
.
23
2.4.7.2
CHROMATOFOKUSSIERUNG
.
24
2.4.8
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
.
24
2.4.8.1
VORBEREITUNG
DES
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE-ELUATES
DURCH
DIALYSE
UND
EINENGEN
.
25
2.4.8.1.1
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
25
2.4.8.1.2
UMPUFFERN/EINENGEN
.
25
2.4.8.2
PROBENVORBEREITUNG
DER
UEBRIGEN
PROBEN
DURCH
PHENOLEXTRAK
TION
UND
EINENGEN
.
25
2.4.8.3
ELEKTROPHORESE
.
26
2.4.8.3.1
GERAETE,
LOESUNGEN
UND
PUFFER
.
26
2.4.8.3.2
DURCHFUEHRUNG
.
27
2.4.8.4
SILBERFAERBUNG
.
28
2.4.8.4.1
LOESUNGEN
.
28
2.4.8.4.2
FAERBEPROZEDUR
.
28
2.4.8.5
MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG
.
28
VII
2.5
IMMUNOLOGISCHE
KREUZREAKTION
MIT
IMMUNSERUM
GEGEN
DIE
GLUCOCEREBROSIDASE
AUS
HUMANPLAZENTA
.
29
2.5.1
IMMUNINHIBITION
UND
IMMUNPRAEZIPITATION
DER
GALLENSAEUREN
SS-GLUCOSI
DASE
AUS
HUMANLEBER
.
29
2.5.2
KONTROLLVERSUCH:
IMMUNINHIBITION
UND
IMMUNPRAEZIPITATION
DER
GLUCOCE
REBROSIDASE
AUS
HUMANLEBER
.
30
3
ERGEBNISSE
.
31
3.1
REINIGUNG
DER
GALLENSAEUREN
SS-GLUCOSIDASE
AUS
HUMANLEBER
.
31
3.2
CHARAKTERISIERUNG
DER
GALLENSAEUREN
SS-GLUCOSIDASE
AUS
HUMANLEBER
.
39
3.2.1
SUBSTRATSPEZIFITAET
UND
MICHAELIS-MENTEN
KONSTANTEN
.
39
3.2.2
INHIBITION
DER
GALIENSAEUREN
SS-GLUCOSIDASE
.
45
3.2.3
LIPIDABHAENGIGKEIT
DER
GALLENSAEUREN
SS-GLUCOSIDASE
.
50
3.2.4
DETERGENSABHAENGIGKEIT
DER
GALLENSAEUREN
SS-GLUCOSIDASE
.
51
3.2.5
STABILITAET
UND
AKTIVIERBARKEIT
DER
GALLENSAEUREN
SS-GLUCOSIDASE
.
52
3.2.6
METALLIONENABHAENGIGKEIT
DER
GALLENSAEUREN
SS-GLUCOSIDASE
.
56
3.2.7
PH-ABHAENGIGKEIT
DER
GALLENSAEUREN
SS-GLUCOSIDASEAKTIVITAET
.
57
3.2.8
IMMUNOLOGISCHE
KREUZREAKTION
MIT
IMMUNSERUM
GEGEN
DIE
GLUCOCERE
BROSIDASE
AUS
HUMANPLAZENTA
.
58
4
DISKUSSION
.
61
5
ZUSAMMENFASSUNG
.
73
6
LITERATURVERZEICHNIS
.
75
7
ANHANG
.
83
7.1
VERZEICHNIS
DER
VERWENDETEN
ABKUERZUNGEN
.
83
7.2
STRUKTURFORMELN
EINIGER
VERWENDETER
CHEMIKALIEN
.
84
7.3
VERZEICHNIS
DER
ABBILDUNGEN
UND
TABELLEN
.
89 |
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