Interleukin 4 und sein Rezeptorsystem: immunologische und gentechnologische Charakterisierung der Aktivierungsepitope
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1996
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
7
1.1
GRUNDSAETZLICHE
UEBERLEGUNGEN
7
1.2
GRUNDLAGEN
DES
IMMUNSYSTEMS
7
13
DAS
UNHEIMLICHE
WESEN
DER
CYTOKINE
10
1.4
STRUKTUR
UND
WIRKUNG
VON
INTERLEUKIN
4
13
1.5
DER
HIL-4
REZEPTOR
17
1.6
GRUNDIDEE
DIESER
ARBEIT
21
1.6.1
DIE
ANTIKOERPEREXPERIMENTE
MIT
DER
HELIX
D
DES
HIL-4
21
1.6.2
DIE
EXPERIMENTE
MIT
DER
HIL-4RA-KETTE
UND
UNTERSUCHUNG
DES
22
HIL-4
REZEPTORSYSTEMS
2
MATERIAL
UND
METHODEN
24
2.1
CHEMIKALIEN
UND
ENZYME
24
2.1.1
LOESUNGEN
UND
PUFFER
24
2.1.2
OLIGONUKLEOTIDE
24
2.1.3
SONSTIGE
MATERIALIEN
UND
GERAETE
25
2.2
MIKROBIOLOGISCHE
UND
MOLEKULARBLOLOGISCHE
METHODEN
26
2.2.1
STERILISIEREN
26
2.2.2
KULTURMEDIEN
26
2.2.3
E.COLI
-
STAEMME
UND
VEKTOREN
26
2.2.4
KONSERVIEREN
VON
BAKTERIENKULTUREN
27
2.2.4.1
KURZZEITIGE
KONSERVIERUNG
27
2.2.4.2
LANGFRISTIGE
KONSERVIERUNG
(GLYCERIN-STAMMKULTUR)
27
2.2.5
KULTURBEDINGUNGEN
27
2.2.6
TRANSFORMATION
VON
E.COLI
S
2.2.6.1
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
28
2.2.6.2
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
ZELLEN
28
2.2.7
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
28
2.2.8
PHENOLISIEREN
VON
NUKLEINSAEUREN
29
2.2.9
AUSFAELLEN
VON
NUKLEINSAEUREN
29
2.2.10
SPALTUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
29
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.11
DNA-AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
30
2.2.12
DNA-GROESSENSTANDARDS
31
2.2.13
ELUTION
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSE-GELEN
31
2.2.14
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
31
2.2.14.1
LIGATION
VON
PCR-PRODUKTEN
31
2.2.14.2
LIGATION
ANDERER
DNA-FRAGMENTE
32
2.2.15
ANALYTISCHE
PLASMIDPRAEPARATION
32
2.2.16
MIDI-PRAEPARATION
VON
PLASMIDEN
33
2.2.17
GEWINNUNG
VON
MRNA
AUS
GEWEBEN
33
2.2.18
SYNTHESE
VON
CDNA
34
2.2.18.1
ERSTSTRANGSYNTHESE
34
2.2.18.2
ZWEITSTRANGSYNTHESE
35
2.2.19
HERSTELLUNG
UND
REINIGUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
35
2.2.20
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
(PCR)
36
2.2.21
DNA-SEQUENZIERUNG
37
2.3
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
38
2.3.1
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
PROTEINEN
38
2.3.1.1
DIREKTE
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
38
2.3.1.2
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
DER
BCA
METHODE
38
2.3.2
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
38
2.3.3
PROTEIN-GROESSENSTANDARDS
39
2.3.4
KOVALENTE
MODIFIKATION
VON
PROTEINEN
40
2.3.4.1
KOPPLUNG
VON
PEPTIDEN
AN
ALBUMIN
MIT
HILFE
VON
MBS
40
2.3.4.2
KOPPLUNG
VON
PROTEINEN
AN
CNBR-AKTIVIERTE
SEPHAROSE
40
2.3.5
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
41
2.3.5.1
HERSTELLUNG
EINER
AFFINITAETSSAEULE
41
2.3.5.2
PROTEINREINIGUNG
DURCH
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
41
2.4
KULTIVIERUNG
VON
EUKORYOTISCHEN
ZELLEN
42
2.4.1
ZELLEN
42
2.4.2
STERILISIEREN
42
2.4.3
MEDIEN
UND
ZUSAETZE
42
2.4.3.1
RPMI
1640
42
2.4.3.2
DMEM
43
2.4.4
KULTURBEDINGUNGEN
43
2.4.5
VITALITAETSFAERBUNG
MIT
TRYPANBLAU
43
2
INHALTSVERZEICHNIS
2.4.6
ZELLDICHTEBESTIMMUNG
43
2.4.7
KRYOKONSERVIERUNG
VON
ZELLEN
44
2.4.7.1
EINFRIEREN
VON
ZELLEN
44
2.4.7.2
AUFTAUEN
VON
KRYOKONSERVIERTEN
ZELLEN
44
2.5
ANTIKOERPER
45
2.5.1
TIERIMMUNISIERUNG
45
2.5.1.1
IMMUNISIERUNG
VON
KANINCHEN
45
2.5.1.2
IMMUNISIERUNG
VON
BALB/C-MAEUSEN
45
2.5.2
GEWINNUNG
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
AUS
IMMUNISIERTEN
MAEUSEN
46
25.2.1
PRAEPARATION
VON
MILZZELLEN
46
2.5.2.2
ZELLFUSION
MIT
PEG
46
2.5.2.3
HAT-SELEKTION
47
2.5.2.4
SCREENING
VON
HYBRIDOMA-KLONEN
47
2.5.2.5
SUBKLONIERUNG
DURCH
GRENZVERDUENNUNG
47
2.6
TRANSFEKTION
EUKARYOTISCHER
ZELLEN
48
2.6.1
PRAEPARATION
DER
DNA
48
2.6.2
VORBEREITUNG
DER
ZELLEN
48
2.6.3
PARAMETER
DER
TRANSFEKTION
48
2.6.4
SELEKTION
DER
TRANSFIZIERTEN
ZELLEN
48
2.6.5
SCREENING
VON
TRANSFEKTANTEN-KLONEN
49
2.7
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
50
2.7.1
VERWENDETE
ANTIKOERPER
50
2.7.2
WESTERN
BLOT
50
2.7.2.1
DETEKTION
DURCH
ALKALISCHE
PHOSPHATASEGEKOPPELTE
51
SEKUNDAERANTIKOERPER
2.72.2
DETEKTION
DURCH
PEROXIDASEGEKOPPELTE
51
SEKUNDAERANTIKOERPER
2.7.3
ELISA
52
2.7.4
RADIOAKTIVER
FESTPHASENASSAY
53
2.7.5
IMMUNPRAEZIPITATION
53
2.7.6
DURCHFLUSSCYTOMETRIE
54
2.7.7
T-ZELL-PROLIFERATIONSTEST
54
2.7.7.1
GEWINNUNG
VON
PHA-BLASTEN
54
3
INHALTSVERZEICHNIS
2.7.7.1.1
ISOLIERUNG
VON
PBMC
AUS
LYMPHOCYTEN-KONZENTRATEN
55
2.7.7.1.2
VORSTIMULIERUNG
VON
PBMC
MIT
PHA
55
2.7.7.2
BESTIMMUNG
DER
BIOLOGISCHEN
AKTIVITAET
VON
CYTOKINEN
AUF
55
PRIMAERE
T-ZELLEN
2.7.7.3
HEMMUNG
DER
CYTOKIN-ABHAENGIGEN
PROLIFERATION
56
DURCH
POLYKLONALES
SERUM
2.7.8
PROLIFERATIONS
UND
KOMPETITIONSTESTS
MIT
ZELLINIEN
56
2.7.9
REZEPTORBINDUNGSTEST
57
3
ERGEBNISSE
59
3.1
ANTIKOERPER
GEGEN
DIE
HELIX
D
DES
HLL-4
59
3.1.1
POLYKLONALE
ANTIKOERPER
GEGEN
DIE
HELIX
D
DES
HIL-4
59
3.1.1.1
HERSTELLUNG
DES
IMMUNOGENS
59
3.1.1.2
IMMUNISIERUNG
DER
VERSUCHSKANINCHEN
60
3.1.1.3
ELISA
DER
KANINCHENSEREN
61
3.1.1.4
WESTERN
BLOT
63
3.1.1.5
VERSUCH
DER
KONZENTRIERUNG
DER
SEREN
DURCH
AFFINITAETSSAEULEN
64
3.1.1.6
HEMMTEST
DER
KANINCHENSEREN
65
3.1.1.7
ANALYSE
DER
VERDRAENGUNG
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
HIL-4S
AUS
68
DER
BINDUNG
AN
HIL-4R
IM
FESTPHASENASSAY
DURCH
KANINCHENSEREN
3.1.1.8
ZUSAMMENFASSUNG
DER
EXPERIMENTE
MIT
POLYKLONALEN
70
ANTIKOERPERN
GEGEN
DIE
HELIX
D
DES
HIL-4
3.1.2
VERSUCH,
MONOKLONALE
ANTIKOERPER
GEGEN
DIE
HELIX
D
DES
HIL-4
71
ZU
ERZEUGEN
3.1.3
SINGLE
-
STRAND
ANTIKOERPER
GEGEN
DIE
HELIX
D
DES
HIL-4
71
32
HYBRIDREZEPTOR
AUS
HLL-4R
X
/
G-CSF-RFO
73
-
ODER
DER
REZEPTOR
4G
3.2.1
DIE
KONSTRUKTION
DES
HIL-4R
EX
/HG-CSF-RI
N
-HYBRIDGENS
75
3.2.1.1
DER
BAUPLAN
DES
KONSTUKTES
75
3.2.1.2
HERSTELLUNG
DES
PKCR-HIL-4RE
X
MOD
75
3.2.1.3
KLONIERUNG
DES
HG-CSF-RJN
78
3.2.1.3.1
PRAEPARATION
DER
MRNA
78
3.2.1.3.2
SYNTHESE
DER
CDNA
78
3.2.1.3.3
KLONIERUNG
DES
HG-CSF-RJN
DURCH
PCR-ANSATZ
79
4
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.1.4
SEQUENZIERUNG
DES
4G-HYBRIDGENS
81
3.2.2
TRANSFEKTION
VON
FDC-PL
ZELLEN
MIT
PKCR
4G:
DIE
ZELLINIE
82
FDC-4G
3.2.3
CHARAKTERISIERUNG
DER
ZELLINIE
FDC-4G
83
3.2.3.1
DURCHFLUSS-CYTOMETRISCHE
ANALYSE
83
32.32
NACHWEISVERSUCH
DES
REZEPTORS
IM
WESTEMBLOT
84
3233
CHARAKTERISIERUNG
DER
ZELLINIE
FDC-4G
DURCH
RADIOLIGANDEN
84
BINDUNG
3.2.3.4
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
PROLIFERATIONSVERHALTEN
DER
ZELLINIE
85
FDC-4G
IN
REAKTION
AUF
HIL-4
UND
HIL-4
VARIANTEN
3.2.3.5
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
CYTOKIN-INDUZIERTEN
TYROSINPHOS
90
PHORYLIERUNG
ZELLULAERER
PROTEINE
IN
FDC-4G
ZELLEN
4
DISKUSSION
92
4.1
DISKUSSION
DER
ANTIKOERPEREXPERIMENTE
92
4.1.1
KRITISCHE
ZUSAMMENFASSUNG
DER
EIGENEN
EXPERIMENTE
92
4.1.2
DAS
PROBLEM
DER
IMMUNOGENITAET
UND
KONFORMATION
DER
HELIX
D
94
IM
KONJUGAT
4.1.3
VERGLEICH
DER
ERGEBNISSE
MIT
LITERATURDATEN
96
4.2
DISKUSSION
DER
EXPERIMENTE
MIT
DEM
REZEPTOR
4G
99
4.2.1
ERZEUGUNG
DER
ZELLINIE
FDC-4G
99
4.2.2
PROLIFERATIONSEXPERIMENTE
MIT
DER
ZELLINIE
FDC-4G
100
4.2.3
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
SIGNALTRANSDUKTION
IN
FDC-4G
ZELLEN
103
4.2.4
ALLGEMEINE
UEBERLEGUNGEN
ZU
HYBRIDREZEPTOREN
103
4.3
DIE
INTERAKTION
ZWISCHEN
HIL-4
UND
SEINEM
REZEPTORSYSTEM
105
5
ZUSAMMENFASSUNG
107
6
ANHANG
108
A
ABKUERZUNGEN
108
B
VERZEICHNIS
DER
ABBILDUNGEN
112
5
INHALTSVERZEICHNIS
C
LITERATURVERZEICHNIS
113
D
SEQUENZEN
128
SEQUENZ
DES
HIL-4
128
AMINOSAEURE-SEQUENZ
DER
HELIX
D
128
CDNA-SEQUENZ
DER
A-KETTE
DES
HIL-4-REZEPTORS
129
CDNA-SEQUENZ
DES
G-CSF-REZEPTORS
130
CDNA-SEQUENZ
DES
HYBRIDREZEPTORS
4G
132
AMINOSAEURE-SEQUENZ
DER
HUMANEN
Y
-KETTE
134
AMINOSAEURE-SEQUENZ
DER
MURINEN
Y-KETTE
134
VARIABLER
BEREICH
DER
SCHWEREN
KETTE
DES
AUF
DER
HELIX
D
135
KARTIERTEN
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERS
31HD6
VARIABLER
BEREICH
DER
LEICHTEN
KETTE
DES
AUF
DER
HELIX
D
135
KARTIERTEN
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERS
3IHD6
E
SCHRIFTENVERZEICHNIS
136
F
DANKSAGUNG
137
G
LEBENSLAUF
138
6 |
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