Expression und biologische Funktion der löslichen Formen von Interleukin-4-Rezeptor-Komponenten:
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INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
1
EINLEITUNG
1
1.1
DAS
NETZWERK
DER
ZYTOKINE
UND
IHRER
REZEPTOREN
1
1.2
DIE
MURINE
LNTERLEUKIN-4-REZEPTOR
A-KETTE
(IL-4R)
3
1.3
DIE
GEMEINSCHAFTLICHE
GAMMA-KETTE
(YC-KETTE)
5
1.4
FRAGESTELLUNGEN
6
2
MATERIAL
UND
METHODEN
8
2.1
MATERIAL
8
2.1.1
CHEMIKALIEN
8
2.1.2
MEDIEN,
PUFFER
UND
LOESUNGEN
10
2.1.3
PCR-PRIMER
UND
ANTISENSE-OLIGONUKLEOTIDE
11
2.1.4
PLASMIDVEKTOREN
12
2.1.5
BAKTERIENSTAEMME
13
2.1.6
ZELLKLONE
UND
ZELLINIEN
13
2.1.7
LYMPHOKINE
UND
ANTIKOERPER
13
2.2
TIERE
14
2.2.1
MAEUSE
14
2.2.2
LEISHMANIEN
14
2.3
METHODEN
15
2.3.1
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
15
2.3.2
REVERSE
TRANSKRIPTION
(RT)
15
2.3.3
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
(PCR)
16
2.3.3.1
QUALITATIVE
PCR
16
2.3.3.2
SEMI-QUANTITATIVE,
KOMPETITIVE
PCR
16
2.3.3
AUFTRENNUNG VON
NUKLEINSAEUREN
UEBER
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
17
2.3.4
KLONIERUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
17
2.3.4.1
SPALTUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN
18
2.3.4.2
EXTRAKTION
UND
FAELLUNG
VON
DNA
18
2.3.4.3
LIGATION
EINES
CDNA-FRAGMENTS
MIT
PLASMID-DNA
18
2.3.4.4
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
BAKTERIEN
19
2.3.4.5
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
MIT
PLASMID-DNA
19
2.3.4.6
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
19
2.3.5
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
20
2.3.6
STABILE
UND
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
VON
SAEUGERZELLEN
21
2.3.7
EXPRESSION
VON
PROTEINEN
IN
SAEUGERZELLEN
21
2.3.8
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHISCHE
REINIGUNG
VON
PROTEINEN
AUS
KULTURUEBERSTAENDEN
TRANSFIZIERTER
ZELLEN
22
2.3.9
QUANTIFIZIERUNG
VON
PROTEINEN
23
2.3.10
ENZYME-IINKED
IMMUNOSORBENT
ASSAYS
(ELISAS)
ZUR
BESTIMMUNG
VON
ZYTOKINEN
UND
LOESLICHEN
ZYTOKINREZEPTOREN
23
2.3.10.1
ELISAS
FUER
ZYTOKINE
23
2.3.10.2
ELISA
FUER
DEN
MURINEN
SLL-4R
24
2.3.10.3
ELISAFUERDIEMURINE
LOESLICHEYC-KETTE
24
2.3.11
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
FUER
MEMBRANSTAENDIGE
ZYTOKINREZEPTOREN
UND
ZELLPOPULATIONSSPEZIFISCHE
OBERFLAECHENMOLEKUELE
24
2.3.12
AUFTRENNUNG
VON
PROTEINEN
UEBER
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
25
2.3.13
FAERBUNG
VON
PROTEINGELEN
26
2.3.14
WESTEM-BLOT-ANALYSEN
27
2.3.15
METABOLISCHE
PROTEINMARKIERUNG
MIT
"
S
IM
PULSE-CHASE-VERFAHREN
28
2.3.16
IMMUNPRAEZIPITATION
RADIOAKTIV
MARKIERTER
PROTEINE
29
2.3.17
ZELLKULTUR
29
2.3.18
EINFRIEREN
UND
AUFTAUEN
VON
ZELLEN
30
2.3.19
ZELLPROLIFERATIONSTESTS
30
2.3.20
INFEKTION
VON
MAEUSEN
MIT
LEISHMANIA
MAJOR
31
2.3.21
ORGANENTNAHME
UND
SERUMGEWINNUNG
AUS
MAEUSEN
31
2.3.22
AUFREINIGUNG
VON
ZELLPOPULATIONEN
32
2.3.23
IN
VITRO
STIMULATION
VON
EINZELZELLSUSPENSIONEN
AUS
MAUSORGANEN
32
3
ERGEBNISSE
33
3.1
EXPRESSION
DER
LOESLICHEN
IL-4R
A-KETTE
(SLL-4R)
AUF
PROTEINEBENE
33
3.1.1
NACHWEIS
DES
SLL-4R
IN
SEREN
VON
MAEUSEN
33
3.1.2
NACHWEIS
DES
SLL-4R
IM
VERLAUF
DER
MURINEN
LEISHMANIOSE
33
3.1.3
NACHWEIS
DES
SLL-4R
IN
UEBERSTAENDEN
VON
IN
VITRO
STIMULIERTEN
NAIVEN
LYMPHKNOTEN
UND
MILZZELLEN
36
3.2
NACHWEIS
DES
IL-4R
AUF
MRNA
EBENE
38
3.2.1
DIFFERENZIERUNG
VON
ZWEI
MRNA
FORMEN
DER
IL-4R
MRNA
(TYP
I
/
TYP
II)
38
3.2.2
EXPRESSION
DER
IL-4R
MRNA
TYP
I
VON
IN
VITRO
STIMULIERTEN
LYMPHKNOTEN
UND
MILZZELLEN
39
3.2.3
EXPRESSION
DER
ALTERNATIV
GESPLEISSTEN
IL-4R
MRNA
TYP
II
41
3.3
DER
EINFLUSS
VON ENDOGENEM
IL-4
AUF
DIE
FREISETZUNG
DES
SLL-4R
41
3.3.1
EXPRESSION
DER
IL-4
MRNA
UNTER
VERSCHIEDENEN
STIMULATIONS
BEDINGUNGEN
41
3.3.2
NACHWEIS
VON
IL-4
IN
UEBERSTAENDEN
VON
IN
VITRO
STIMULIERTEN
MILZZELLEN
42
3.3.3
PARTIELLE
HEMMUNG
DER
SLL-4R
FREISETZUNG
DURCH
ANTI
IL-4
ANTIKOERPER
IN
VITRO
43
3.3.4
FREISETZUNG
DES
SIL-4R
IN
IL-4-DEFIZIENTEN
MAEUSEN
46
3.4
DIFFERENTIELLE
REGULATION
DER
SLL-4R
FREISETZUNGSWEGE
46
3.4.1
EXPERIMENTE
MIT
PROTEASE-
UND
KINASEINHIBITOREN
SOWIE
CYCLOSPORIN
A
47
3.4.2
HEMMUNG
DER
IL-4-INDUZIERTEN
SLL-4R
FREISETZUNG
DURCH
ANTISENSE-OLIGONUKLEOTIDE
49
3.4.3
IMMUNPRAEZIPITATION
VON
SLL-4R
AUS
UEBERSTAENDEN
TRANSFIZIERTER
COS-7.1
ZELLEN
51
3.5
DIE
ROLLE
DER
YC-KETTE
BEI
DER
FREISETZUNG
DES
SLL-4R
52
3.5.1
DER
EINFLUSS
VON
ANTI
YC-KETTEN
ANTIKOERPERN
AUF
DIE
FREISETZUNG
DES
SLL-4R
53
3.5.2
DER
EINFLUSS
DER
ZYTOKINE
IL-2,
IL-7
UND
IL-9
AUF
DIE
FREISETZUNG
DES
SIL-4R
54
3.5.3
INDUKTION
DER
SLL-4R
FREISETZUNG
DURCH
MURINES
IL-4Y119D
(IL-4-MUTEIN)
54
3.6
EXPRESSION
DER
MURINEN
YC-KETTE
55
3.6.1
EXPRESSION
DER
MRNA
FUER
DIE
YC-KETTE
IN
VERSCHIEDENEN
ZELLPOPULATIONEN
56
3.6.2
REGULATION
DER
EXPRESSION
DER
YC-KETTE
AUF
MRNA
EBENE
56
3.7
NACHWEIS
DER
LOESLICHEN
YC-KETTE
(SYC-KETTE)
IN
MAUSSEREN
UND
UEBERSTAENDEN
VON
ZELLKULTUREN
57
3.7.1
KLONIERUNG,
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
EINER
REKOMBINANTEN
SYC-KETTE
57
3.7.2
QUANTITATIVER
NACHWEIS
DER
SYC-KETTE
IM
ELISA
59
3.7.3
FREISETZUNG
DER
SYC-KETTE
AUS
TRANSFIZIERTEN
COS-7.1ZELLEN
(COS-7.1/YC)
62
3.8
BIOLOGISCHE
WIRKUNG
DER
REKOMBINANTEN
SYC-KETTE
IN
VITRO
64
4
DISKUSSION
66
4.1
FREISETZUNG
DES
SLL-4R
WAEHREND
DER
MURINEN
LEISHMANIOSE
4.2
SLL-4R
FREISETZUNG
DURCH
ALTERNATIVES
SPLEISSEN
NACH
IL-4
STIMULATION
66
68
4.3
FREISETZUNG
DES
SLL-4R
DURCH
INDUZIERBARE
PROTEOLYTISCHE
ABSPALTUNG
71
4.4
KEIN
EINFLUSS
DER
YC-KETTE
AUF
DIE
FREISETZUNG
DES
SLL-4R
75
4.5
FREISETZUNG
DER
MURINEN
SYC-KETTE
76
4.6
DIE
POTENTIELLE
ROLLE
LOESLICHER
ZYTOKINREZEPTOREN
78
5
ZUSAMMENFASSUNG
83
6
LITERATURVERZEICHNIS
85 |
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