Zelluläre Lokalisation und biochemische Charakterisierung der Phosphofruktokinase-Isoenzyme im Gehirn der Ratte:
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1. EINLEITUNG UND AUFGABENSTELLUNG 1
1.1. EIGENSCHAFTEN DER PHOSPHOFRUKTOKINASE 1
1.1.1. STRUKTUR UND FUNKTION DER PHOSPHOFRUKTOKINASE 1
1.1.2. GENETISCHE ASPEKTE DER PHOSPHOFRUKTOKINASE 8
1.1.3. INTERAKTION DER PHOSPHOFRUKTOKINASE MIT VERSCHIEDENEN
ZELLBESTANDTEILEN 9
1.2. ROLLE DES GLUKOSESTOFFWECHSELS UND DES CHOLINERGEN SYSTEMS BEI DER
ALZHEIMERSCHEN ERKRANKUNG 12
1.3. TIERMODELLE FUER BESTIMMTE ASPEKTE DER NEUROPATHOLOGIE DER
ALZHEIMERSCHEN ERKRANKUNG 17
1.4. AUFGABENSTELLUNG 21
2. MATERIAL UND METHODEN 23
2.1. VERSUCHSTIERE 23
2.2, BESTIMMUNGEN VON ENZYMAKTIVITAETEN 23
2.2.1. BESTIMMUNG DER PHOSPHOFRUKTOKINASE-AKTIVITAET 23
2.2.2. RADIOCHEMISCHE BESTIMMUNG DER CHOLINACETYLTRANSFERASE-AKTIVITAET
24
2.2.3. ENZYMHISTOCHEMISCHE DARSTELLUNG DER
ACETYLCHOLINESTERASE-AKTIVITAET 24
2.2.4. PHOTOMETRISCHE BESTIMMUNG DER ACETYLCHOLINESTERASE NACH ELLMANN
25
2.2.5. BESTIMMUNG DES DESOXYRIBONUKLEINSAEURE-GEHALTES ALS
CHARAKTERISTIKUM
FUER DIE KEMFRAKTION 25
2.2.6. BESTIMMUNG DER AKTIVITAET DER 2', 3' ZYKLISCHE
NUKLEOTID-3'-PHOSPHODI-
ESTERASE ALS MARKERENZYM FUER MYELIN 26
2.2.7. BESTIMMUNG DER GLUTAMATDEHYDROGENASE-AKTIVITAET ALS
MITOCHONDRIENMARKER 26
2.2.8. BESTIMMUNG DER GLUKOSE-6-PHOSPHATASE-AKTIVITAET ALS
MIKROSOMENMARKER 26
2.2.9. BESTIMMUNG DER LAKTATDEHYDROGENASE-AKTIVITAET 27
2.3. TRENNUNG UND NACHWEIS DER PHOSPHOFRUKTOKINASE-ISOFORMEN 27
2.3.1. NATRIUMDODECYLSULFAT-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE 27
2.3.2. PROTEIN-SILBERFAERBUNG 28
2.3.3. WESTERN-BLOT 29
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2.3.4. NATIVE POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE UND DETEKTION DER
PHOSPHOFRUKTOKINASE-AKTIVITAET MITTELS AKTIVFARBUNG IM GEL 30
2.4. ZELLULAERE LOKALISATION DER PHOSPHOFRUKTOKINASE-ISOENZYME UND DER
PHOSPHOFRUKTOKINASE-AKTIVITAET 30
2.4.1. PRAEPARATION NEURALER ZELLFRAKTIONEN 3 0
2.4.1.1. ISOLIERUNG VON NEURONEN- UND ASTROZYTENFRAKTIONEN AUS DEM
RATTENHIM 30
2.4.1.2. ISOLIERUNG EINER OLIGODENDROGLIAFRAKTION AUS DEM RATTENHIM 31
2.4.2. NEURALE ZELLKULTUREN AUS DEM RATTENHIM 32
2.4.2.1. PRAEPARATION EINER ASTROZYTENREICHEN PRIMAEREN ZELLKULTUR 32
2.4.2.2. HERSTELLUNG VON KONDITIONIERTEM MEDIUM 33
2.4.2 3. PRAEPARATION EINER NEURONENREICHEN PRIMAEREN ZELLKULTUR 34
2.4.2.4. PRAEPARATION EINER OLIGODENDROGLIAREICHEN SEKUNDAEREN ZELLKULTUR
35
2.4.2.5. PRAEPARATION EINER MIKROGLIAREICHEN SEKUNDAEREN ZELLKULTUR 36
2.5. LAESION DES CHOLINERGEN BASALEN VORDERHIMS DER RATTE MITTELS DES
IMMUNOTOXINS 192IGG-SAPORIN 36
2.6. IMMUNHISTOCHEMIE UND IMMUNZYTOCHEMIE 37
2.6.1. VORBEHANDLUNG DER GEHIRNE UND HERSTELLUNG VON GEHIMSCHNITTEN 37
2.6.2. VORBEHANDLUNG DER ZELLEN 37
2.6.3. NACHWEIS VERSCHIEDENER ZELLTYPEN DES RATTENHIMS 3 8
2.6.4. DARSTELLUNG DER PHOSPHOFRUKTOKINASE IN VERSCHIEDENEN
ZELLPOPULATIONEN
MIT POLY- UND MONOKLONALEN ANTIKOERPERN 39
2.7. GEWINNUNG SUBZELLULAERER FRAKTIONEN AUS DEM RATTENHIM 39
2.8. UEBERPRUEFUNG VON VERSCHIEDENEN KOMPLEMENTAEREN
DESOXYRIBONUKLEINSAEURE-
SONDEN AUF PHOSPHOFRUKTOKINASE-ISOENZYMSPEZIFITAET 40
2.8.1. PLASMIDPRAEPARATION 41
2.8.2. SEQUENZSPEZIFISCHE SPALTUNG DER PLASMID- DESOXYRIBONUKLEINSAEURE
MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN 41
2.8.3. DESOXYRIBONUKLEINSAEURE-AGAROSEGELELEKTROPHORESE 41
2.8.4. ELUTION VON DESOXYRIBONUKLEINSAEURE-FRAGMENTEN 42
2.8.5. LIGATION VON DESOXYRIBONUKLEINSAEURE-FRAGMENTEN 42
2.8.6. HERSTELLUNG KOMPETENTER ESCHERICHIA COLI-ZELLEN 42
2.8.7. TRANSFORMATION VON ESCHERICHIA COLI-ZELLEN 43
2.8.8. POLYMERASE-KETTENREAKTION 43
2.8.9. RIBONUKLEINSAEURE-PRAEPARATION 44
2.8.10. RIBONUKLEINSAEURE-AGAROSEGELELEKTROPHORESE 45
2.8.11 SYNTHESE VON RADIOAKTIV MARKIERTEN RIBONUKLEINSAEURE-SONDEN 45
46
2.8.12. NORTHEM-BLOT ANALYSE
2.9. DENSITOMETRISCHE UND STATISTISCHE AUSWERTUNG
3.
3.1.
3.1.1.
3.1.2.
3.1.3.
3.1.4.
3.2.
3.2.1.
3.2.2.
3.3.
3.3.1.
3.3.2.
3.3.3.
3.3.4.
3.4.
3.4.1.
3.4.2.
ERGEBNISSE
47
48
ZELLULAERE VERTEILUNG DER PHOSPHOFRUKTOKINASE-ISOENZYME UND DER
PHOSPHOFRUKTOKINASE-AKTIVITAET IN VERSCHIEDENEN PRIMAEREN UND SEKUNDAEREN
ZELLKULTUREN UND ISOLIERTEN ZELLFRAKTIONEN AUS RATTENHIM 48
IMMUNHISTOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER REINHEIT DER ISOLIERTEN
ZELLFRAKTIONEN UND DER ZELLKULTUREN 48
VERTEILUNG DER PHOSPHOFRUKTOKINASE-ISOENZYME IN PRIMAEREN UND
SEKUNDAEREN ZELLKULTUREN 50
VERTEILUNG DER PHOSPHOFHIKTOKINASE-ISOENZYME IN ISOLIERTEN
ZELLFRAKTIONEN
DES RATTENHIMS 53
PHOSPHOFRUKTOKINASE-AKTIVITAET IN ZELLKULTUREN UND ISOLIERTEN
ZELLFRAKTIONEN AUS DEM RATTENHIM 54
IMMUNHISTOCHEMISCHE DARSTELLUNG DER PHOSPHOFRUKTOKINASE IM RATTENHIM
MITTELS POLYKLONALER ANTISEREN UND MONOKLONALER ANTIKOERPER 56
DARSTELLUNG DER PHOSPHOFRUKTOKINASE MITTELS POLYKLONALER ANTISEREN 56
DARSTELLUNG DER PHOSPHOFRUKTOKINASE MITTELS MONOKLONALER ANTIKOERPER 58
VERTEILUNG DER PHOSPHOFRUKTOKINASE-ISOENZYME UND DER PHOSPHO-
FRUKTOKINASE-AKTIVITAET IN SUBZELLULAEREN FRAKTIONEN DES RATTENHIMS 62
VERTEILUNG VON MARKERENZYMAKTIVITAET IN DEN SUBZELLULAEREN FRAKTIONEN
AUS DEM RATTENHIM 62
VERTEILUNG DER PHOSPHOFRUKTOKINASE-AKTIVITAET 64
VERTEILUNG DER LAKTATDEHYDROGENASE-AKTIVITAET 65
VERTEILUNG DER PHOSPHOFRUKTOKINASE-ISOENZYME 66
AUFTRENNUNG DER PHOSPHOFRUKTOKINASE MITTELS NATIVER POLYACRYLAMID
GELELEKTROPHORESE 67
NATIVE POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE 67
AUFTRENNUNG DER NATIVEN PHOSPHOFRUKTOKINASE-SPEZIFISCHEN BANDEN MITTELS
NATRIUMDODECYLSULFAT-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE 68
3.5.
3.5.1.
LAESION DES CHOLINERGEN BASALEN VORDERHIMS DER RATTE MITTELS DES
IMMUNOTOXINS 192IGG-SAPORIN
NACHWEIS DER CHOLINERGEN HYPOFUNKTION
68
68
3 5,1.1. ERMITTLUNG DER CHOLINACETYLTRANSFERASE-AKTIVITAET 68
3.51.2. ERMITTLUNG DER ACETYLCHOLINESTERASE-AKTIVITAET 70
3.5.1.3. HISTOCHEMISCHE DARSTELLUNG DER AEETYLCHOLINESTERASE 72
3.5.2. VERAENDERUNG DER PHOSPHOFRUKTOKINASE-AKTIVITAET NACH IMMUNOLAESION
75
3.5.3. VERAENDERUNG DES PHOSPHOFRUKTOKINASE-ISOENZYMMUSTERS NACH
IMMUNOLAESION 77
3.6. UEBERPRUEFUNG DER PHOSPHOFHIKTOKINASE-ISOENZYMSPEZIFITAET
VERSCHIEDENER
KOMPLEMENTAEREN DESOXYRIBONUKLEINSAEURE-SONDEN 79
3.6.1. RESTRIKTIONSANALYSE UND UMKLONIERUNG DER KOMPLEMENTAEREN
DESOXYRIBONUKLEINSAEURE-SONDEN 79
3.6.2. RIBONUKLEINSAEURE-ISOLIERUNG UND ELEKTROPHORESE 82
3.6.3. NORTHEM-BLOT ANALYSE 83
4. DISKUSSION 86
VERTEILUNG DER PHOSPHOFRUKTOKINASE-ISOENZYME UND DER PHOSPHO
FRUKTOKINASE-AKTIVITAET IN VERSCHIEDENEN ZELLULAEREN FRAKTIONEN UND
ZELLKULTUREN AUS DEM RATTENHIM UND AN RATTENHIRNSCHNITTEN 86
NACHWEIS DER PHOSPHOFRUKTOKINASE-AKTIVITAET UND DER ISOFORMEN DES
ENZYMS IN VERSCHIEDENEN SUBZELLULAEREN KOMPARTIMENTEN IM RATTENHIM 93
VERAENDERUNGEN DER AKTIVITAET CHOLINERGER MARKER UND DER PHOSPHO
FRUKTOKINASE UND DES PHOSPHOFRUKTOKINASE-ISOENZYMMUSTERS NACH
CHOLINERGER LAESION DES BASALEN VORDERHIMS DER RATTE 95
4.4. NACHWEIS DER MESSENGER RIBONUKLEINSAEUREN DER PHOSPHOFRUKTOKINASE
MITTELS NORTHEM-BLOT ANALYSE 100
5. ZUSAMMENFASSUNG 103
6.
LITERATUR 107 |
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