Entwicklung und Anwendung NMR-spektroskopischer Methoden zur Strukturbestimmung von Proteinen:
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INHALT
1. EINLEITUNG
2. METHODEN
2.1. MEHRDIMENSIONALE PULS-FOURIER-TRANSFORM NMR-SPEKTROSKOPIE
2.1.1. PROJEKTION VON FREQUENZKOORDINATEN
2.2. INVERSE SPEKTROSKOPIE
2.2.1. H,X - KORRELATIONEN
2.2.2. H - RELAYED - H,X - KORRELATIONEN
2.2.3. TRIPELRESONANZ- UND HCCH-EXPERIMENTE
2.3. KOHAERENZSELEKTION
2.3.1. PHASENZYKLEN
2.3.2. B0-FELDGRADIENTEN
2.4. UNTERSCHEIDUNG VON POSITIVEN UND NEGATIVEN, INDIREKT DETEKTIERTEN
REQUENZEN
2.4.1. ALTERNIERENDE AUFNAHME VON REAL- UND IMAGINAERTEUE
2.4.2. SIMULTANE AUFNAHME VON REAL- UND IMAGINAERTEIL
2.4.3. ECHO/ANTIECHO-KOHAERENZSELEKTION
2.4.3.1 YY ECHO/ANTIECHO-KOHAERENZSELEKTION DURCH B0 - FELDGRADIENTEN
2.5. EMPFINDLICHKEITSSTEIGERUNG
2.6. YYCONSTANT-TIME"-EVOLUTIONSPERIODEN
2.6.1. YYSEMI CONSTANT-TIME"-EVOLUTIONSPERIODEN
2.7. MESSUNG VICINALER KOPPLUNGSKONSTANTEN
2.7.1. E.COSY-EXPERIMENTE
2.7.2.
J - MODULATION
2.7.3. QUANTITATIVE J - KORRELATION
3. EXPERIMENTE
3.1. PRAEPARATION VON REKOMBINANTEM DESULFOVIBRIO VULGARIS FLAVODOXIN
3.1.1. TRANSFORMATION VON
E.COLI
3.1.2. EXPRESSION DES FLAVODOXINS IN E.COLI
3.1.3. ISOLIERUNG UND REINIGUNG DES FLAVODOXINS
3.1.4. HERSTELLUNG DER NMR-PROBEN
3.2. NMR-MESSUNGEN
3.2.1. SPEKTROMETER-HARDWARE
3.2.1.1. AM 500-SPEKTROMETER
3.2.1.2. AMX 500/600-SPEKTROMETER
3.2.1.3. DMX 500/600-SPEKTROMETER
3.2.2. PULSE UND WARTEZEITEN
3.2.3. SPEKTRENREFERENZIERUNG
3.2.4. PROZESSIERUNG DER SPEKTREN
3.2.5. BESTIMMUNG DER KOPPLUNGSKONSTANTEN AUS E.COSY-SPEKTREN
4. ERGEBNISSE UND DISKUSSION
4.1. ZUORDNUNG DER RESONANZEN DES OXIDIERTEN FLAVODOXINS AUS
DESULFOVIBRIO VULGARIS
4.1.1. ZUORDNUNG DER 'H - UND
,5N - RESONANZEN
4.1.2. ZUORDNUNG DER 13C - RESONANZEN
4.1.2.1. KORRELATIONEN DER RESONANZEN DES PROTEINRUECKGRATS
1
11
11
17
19
19
22
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29
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73
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99
99
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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4.1.2.1.1. BESCHREIBUNG DER PULSSEQUENZEN 100
4.1.2.1.2. ZUORDNUNGSSTRATEGIE 112
4.1.2.1.3. UEBERPRUEFUNG DER ZUORDNUNG DURCH EXPERIMENTE MIT REDUZIERTER
DIMENSIONALITAET 114
4.1.2.2. KORRELATIONEN DER SEITENKETTENRESONANZEN 122
4.1.2.2.1. AMINOSAEUREN MIT ALIPHATISCHEN SEITENKETTEN 124
4.1.2.2.2. AMINOSAEUREN MIT AROMATISCHEN SEITENKETTEN 129
4.1.2.3. KORRELATIONEN ZWISCHEN PROTEINRUECKGRAT- UND
SEITENKETTENRESONANZEN 137
4.1.3. ZUORDNUNG DER RESONANZEN DES FMN 151
4.2. ERMITTLUNG VON SEKUNDAERSTRUKTURELEMENTEN 156
4.2.1. IDENTIFIZIERUNG RELEVANTER NOE'S 156
4.2.2. SEKUNDAERE CHEMISCHE VERSCHIEBUNGEN 164
4.2.3. BESCHREIBUNG DER SEKUNDAERSTRUKTUR 167
4.3. LOKALISIERUNG PROTEINGEBUNDENER WASSERMOLEKUELE 170
4.3.1. PROBLEMATIK 170
4.3.2. AUSWAHL DER PULSSEQUENZEN 174
4.3.3. INTERPRETATION DER SPEKTREN 177
4.4. BESTIMMUNG DER KONFORMATION DES PROTEINRUECKGRATS MIT HILFE
VICINALER
KOPPLUNGSKONSTANTEN 182
4.4.1. EINSCHRAENKUNG DES | - WINKELS 183
4.4.1.1. (H)NCAHA- UND (H)CANNH-EXPERIMENTE 183
4.4.1.2. SYSTEMATISCHE FEHLER DURCH DIFFERENTIELLE RELAXATION - DAS 'H
A - GEKOPPELTE
HNCA-EXPERIMENT 188
4.4.1.3. DAS J - MODULIERTE 'H,
I5N - KORRELATIONSEXPERIMENT 190
4.4.1.4. DAS (H)CA(N)CO(N)H-EXPERIMENT 192
4.4.1.5. DAS
,3CP - GEKOPPELTE HNHB-EXPERIMENT 194
4.4.1.6. DAS
L3CO - GEKOPPELTE HMQC-COSY-EXPERIMENT 196
4.4.1.7. BEISPIELE FUER DIE BESTIMMUNG DES | - WINKELS DURCH
KOMBINATION
HOMONUKLEARER UND HETERONUKLEARER KOPPLUNGSKONSTANTEN 200
4.4.2. EINSCHRAENKUNG DES
\\I - WINKELS 203
4.5. INDIVIDUELLE ZUORDNUNG GEMINALER PROTONENRESONANZEN 207
4.5.1. STEREOSPEZIFISCHE RESONANZUORDNUNG VON GLYCIN - A - PROTONEN 208
4.5.2. STEREOSPEZIFISCHE RESONANZZUORDNUNG VON SS - METHYLENPROTONEN 209
4.5.2.1. QUALITATIVE BESTIMMUNG INTRARESIDUALER PROTONENABSTAENDE 210
4.5.2.2. KOMBINATION VON NOE-INFORMATION MIT QUALITATIV BESTIMMTEN
KOPPLUNGSKONSTANTEN 217
4.5.2.3. QUANTITATIVE BESTIMMUNG VICINALER KOPPLUNGSKONSTANTEN 223
4.5.2.3.1. MESSUNG VON
3JHPCO 223
4.5.2.3.2. MESSUNG VON 3JHN 226
4.5.2.3.3. MESSUNG VON 3JHAHP 229
4.5.3. UNTERSCHEIDUNG CIS- UND TRANSSTAENDIGER SEITENKETTEN-AMIDPROTONEN
232
5. ZUSAMMENFASSUNG 235
LITERATUR 237
ANHANG 257
A TABELLEN 257
B PULSPROGRAMME 274
C FELIX-MAKROS 298 |
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