Das Pyruvat-Formiat-Lyase-Operon von Escherichia coli: Untersuchungen zur Regulation
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INHALTSVERZEICHNIS
EINLEITUNG
1
I.
ENERGIESTOFFWECHSEL
VON
ESCHERICHIA
COLI
1
II.
REGULATION
DES
ENERGIESTOFFWECHSELS
3
HI.
PYRUVATABBAU
DURCH
ESCHERICHIA
COLI
6
IV.
PYRUVAT-DEHYDROGENASE-KOMPLEX
UND
PYRUVAT-FORMIAT-LYASE
7
MATERIAL
UND
METHODEN
12
1.
BAKTERIENSTAEMME,
PLASMIDE
UND
BAKTERIOPHAGEN
12
2.
NAEHRMEDIEN
UND
PUFFER
18
3.
ANZUCHTBEDINGUNGEN
UND
VERMEHRUNG
VON
M13-PHAGEN
19
4.
GENETISCHE
METHODEN
20
4.1
PL-TRANSDUKTION
20
4.2
INTEGRATION
VON
ZACZ-FUSIONEN
ALS
EINZELKOPIEN
IN
DAS
CHROMOSOM
20
5.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
20
5.1
ISOLIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
20
5.1.1
CHROMOSOMALE
DNA
20
5.1.2
PLASMID-DNA
20
5.1.3
PRAEPARATION
VON
EINZELSTRAENGIGER
ML3-DNA
21
5.1.4
GESAMT-RNA
21
5.1.5
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
21
5.2
KLONIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
21
5.2.1
ENZYMATISCHE
IN
VITRO-REAKTIONEN
AN
DNA
21
5.2.2
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
-ZELLEN
21
5.3
IN
VZTRO-MARKIERUNG
VON
DNA
MIT
[
32
P]
22
5.4
PRIMER
EXTENSION
22
5.5
AMPLIFIZIERUNG
VON
DNA
MIT
HILFE
DER
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
22
5.6
DNA-SEQUENZIERUNG
23
5.6.1
ENZYMATISCHE
METHODE
23
5.6.2
CHEMISCHE
METHODE
23
5.7
MUTAGENESE
MIT
EINZELSTRAENGIGER
ML3-DNA
23
6.
ELEKTROPHORETISCHE
TRENNMETHODEN
24
6.1
ELEKTROPHORESE
VON
DNA-FRAGMENTEN
IN
AGAROSEGELEN
24
6.2
ELEKTROPHORESE
VON
DNA
IN
HAMSTOFF-POLYACRYLAMIDGELEN
24
6.3
ELEKTROPHORESE
VON
DNA/PROTEIN-KOMPLEXEN
IN
POLYACRYLAMIDGELEN
UNTER
NATIVEN
BEDINGUNGEN
24
6.4
ELEKTROPHORESE
VON
PROTEINEN
IN
SDS-POLYACRYLAMIDGELEN
25
7.
ANALYTISCHE
METHODEN
25
7.1
BESTIMMUNG
DER
NUKLEINSAEUREKONZENTRATION
25
7.2
PROTEINBESTIMMUNG
25
7.3
SZINTILLATIONSMESSUNG
25
7.4
SEQUENZIERUNG
DES
N-TERMINUS
VON
PROTEINEN
25
7.5
QUANTIFIZIERUNG
DES
EISENGEHALTES
VON
GEREINIGTEM
FNR-PROTEIN
25
7.6
COMPUTERGESTUETZTE
QUANTIFIZIERUNG
VON
PRODUKTEN
AUS
IN
VITRO-TRANSKRIPTIONEN,
DNASEL-SCHUTZEXPERIMENTEN
UND
WESTEM-BLOT-ANALYSEN
26
8.
PHYSIOLOGISCHE
METHODEN
26
8.1
QUALITATIVER
TEST
AUF
GASBILDUNG
26
8.2
B-GALAKTOSIDASE-TEST
26
9.
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
26
10.
SPEZIFISCHE
SYNTHESE,
UEBERPRODUKTION
UND
MARKIERUNG
VON
GENPRODUKTEN
UEBER
GEEIGNETE
EXPRESSIONSSYSTEME
27
10.1
EXPRESSION
UNTER
KONTROLLE
DES
T7- I
1
0-PROMOTORS
27
10.2
UEBEREXPRESSION
UNTER
KONTROLLE
DES
ZAC-PROMOTORS
27
11.
UEBERPRODUKTION
UND
REINIGUNG
VON
PROTEINEN
27
11.1
UEBERPRODUKTION
UND
REINIGUNG
VON
FNR
27
11.2
UEBERPRODUKTION
UND
REINIGUNG
VON
NARL
29
11.3
UEBERPRODUKTION
UND
REINIGUNG
VON
NARP
29
11.4
REINIGUNG
VON
ARCA
30
12.
IN
VITRO
-PHOSPHORYLIERUNG
VON
PROTEINEN
30
13.
IN
ROERO-EXPERIMENTE
ZUR
INTERAKTION
VON
PROTEIN
UND
DNA
30
13.1
GELRETARDATIONSEXPERIMENTE
30
13.2
DNASEL-SCHUTZEXPERIMENTE
31
13.3
IN
VIRRO-TRANSKRIPTIONSAKTIVIERUNG
DURCH
FNR
32
14.
LISTE
DER
VERWENDETEN
OLIGONUKLEOTIDE
32
15.
BEZUGSQUELLE
BESONDERER
ENZYME
UND
CHEMIKALIEN
33
ERGEBNISSE
34
1.
UEBERPRODUKTION
UND
REINIGUNG
VON
FNR
34
1.1
KLONIERUNG
VON
FNR
34
1.2
UEBERPRODUKTION
UND
REINIGUNG
VON
FNR
35
1.3
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
DES
GEREINIGTEN
FNR
36
2.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
BINDUNG
VON
FNR
AN
DIE
REGULATORISCHE
REGION
DES
P/L-OPERONS
37
2.1
DNASEL-SCHUTZEXPERIMENTE
39
2.2
EINFLUSS
WEITERER
FNR-BINDESEQUENZ-MUTATIONEN
AUF
DIE
BINDUNG
VON
FNR
41
3.
IN
VFFRO-TRANSKRIPTIONSAKTIVIERUNG
VON
PROMOTOR
P6
DURCH
FNR
43
3.1
IN
VITRO-AKTIVIERUNG
VON
PROMOTOR
P6
DURCH
FNR
43
3.2
EINFLUSS
VERSCHIEDENER
FNR-BINDESEQUENZ-MUTATIONEN
AUF
DIE
AKTIVIERBARKEIT
VON
PROMOTOR
P6
DURCH
FNR
45
4.
BEDEUTUNG
DER
FNR-BINDESEQUENZ-MUTATIONEN
FUER
DIE
REGULATION
DES
PROMOTORS
P6
IN
VIVO
47
4.1
EFFEKTE
PERFEKTER
FNR- ODER
CRP-ERKENNUNGSSEQUENZEN
AUF
DIE
TRANSKRIPTION
VON
PROMOTOR
P6
IN
VIVO
47
4.2
EINFLUSS
DER
HYBRIDEN
CRP-FNR-BINDESTELLE
AUF
DIE
TRANSKRIPTION
VON
PROMOTOR
P6
IN
VIVO
50
4.3
AUSWIRKUNG
VON
FNR-1
UND
CF-MUTATIONEN
AUF
DIE
FNR-ABHAENGIGE
REGULATION
VON
PROMOTOR
P6
51
5.
NAEHERE
CHARAKTERISIERUNG
DES
P6A-PROMOTORS
52
5.1
PRIMER
EXTENSION-ANALYSE
53
5.2
EINFLUSS
VON
MUTATIONEN
DES
-10-SEQUENZMOTIVS
DER
PROMOTOIEN
P6
UND
P6A
AUF
DIE
P/Z-EXPRESSION
53
5.2.1
EXPRESSION
VON
P/Z-ZACZ-TRANSKRIPTIONSFUSIONEN
53
5.2.2
PRIMER
EXTENSION-ANALYSE
DER
P/Z-ZACZ-TRANSKRIPTE
56
5.3.
EXPRESSION
VON
PROMOTORMUTATIONEN
TRAGENDEN
P/Z-ZACZ-TRANSKRIPTIONSFUSIONEN:
EINFLUSS
VON
PROMOTER
P7
57
5.4
AUSWIRKUNG
DER
MUTATION
DES
-10-SEQUENZMOTIVS
VON
PROMOTOR
P6A
AUF
DIE
EXPRESSION
DES
P/Z-OPERONS
59
6.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
REPRESSION
DER
ANAEROBEN
EXPRESSION
DES
P/Z-OPERONS
DURCH
NITRAT
61
6.1
EFFEKTE
VON
NITRAT
UND
NITRIT
AUF
DIE
ANAEROBE
EXPRESSION
VON
PFL
61
6.2
EINFLUSS
VERSCHIEDENER
MUTATIONEN
DER
NITRAT-ABHAENGIGEN
SENSOR-REGULATOR-SYSTEME
62
6.3
BEDEUTUNG
DES
NITRATSTOFFWECHSELS
63
6.4
AUSWIRKUNG
VERSCHIEDENER
REGULATORISCHER
MUTATIONEN
64
6.5
EINGRENZUNG
DER
FUER
DIE
REPRESSION
VERANTWORTLICHEN
SEQUENZ
IN
DER
REGULATORISCHEN
REGION
DES
P/Z-OPERONS
65
7.
UEBERPRODUKTION
UND
REINIGUNG
VON
NARL
UND
NARP
67
7.1
KLONIERUNG
VON
NARL
UND
NARP
67
7.2
UEBERPRODUKTION
VON
NARL
UND
NARP
67
7.3
REINIGUNG
VON
NARL
68
7.4
REINIGUNG
VON
NARP
69
7.5
BESTIMMUNG
DER
N-TERMINALEN
AMINOSAEURESEQUENZ
VON
NARL
UND
NARP
70
8.
INTERAKTION
VON
NARL
MIT
DER
REGULATORISCHEN
REGION
DES
P/I-OPERONS
70
8.1
IN
VITRO-PHOSPHORYLIERUNG
VON
NARL
71
8.2
GELRETARDATIONSEXPERIMENTE
71
8.3
DNASEL-SCHUTZEXPERIMENTE
73
9.
VERSUCHE
ZUR
INTERAKTION
VON
NARP
MIT
DER
REGULATORISCHEN
REGION
DES
P/7-OPERONS
7
6
10.
AUSWIRKUNGEN
VON
NARL-BINDESTELLE-MUTATIONEN
AUF
DIE
REPRESSION
DES
P/Z-OPERONS
DURCH
NITRAT
77
10.1
IN
VITRO-MUTAGENESE
AUSGEWAEHLTER
NARL-BINDESTELLEN
77
10.2
EFFEKT
DER
NARL-MUTATIONEN
AUF
DIE
P/Z-EXPRESSION
79
DISKUSSION
80
ZUSAMMENFASSUNG
91
LITERATURVERZEICHNIS
92 |
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