Klonierung und Charakterisierung einer Zink-Finger-Proteinkinase von Trypanosoma brucei:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1996
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INHALTSVERZEICHNIS
I.
EINLEITUNG
1
1.1.
SYSTEMATISCHE
UND
PHYLOGENETISCHE
EINORDNUNG
1
1.2
PATHOLOGIE
UND
EPIDEMIOLOGIE
3
I
3
MORPHOLOGIE,
LEBENSZYKLUS
UND
BIOLOGISCHE
BESONDERHEITEN
BEI
TRYPANOSOMEN
4
1.4
GRUNDSAETZLICHES
ZU
PROTEINPHOSPHORYLIERUNG
UND
PROTEINKINASEN
7
1
5
PROTEINPHOSPHORYLIERUNG
UND
PROTEINKINASEN
BEI
KINETOPLASTIDEN
9
I
6
ZIELE
DER
ARBEIT
11
II.
MATERIAL
UND
METHODEN
12
11.1
GERITE,
CHEMIKALIEN,
ENZYME
UND
SONSTIGE
MATERIALIEN
12
II.
1.1
GERAETE
12
II
1
2
CHEMIKALIEN
12
IL.L
3
ENZYME
13
II
1
4
MEMBRANEN
13
II
1.5
KITS
14
II
1.6
COMPUTERPROGRAMME
14
11.2
BIOLOGISCHES
MATERIAL
14
II.
2.1
TRYPANOSOMEN
14
II.
2.2
PHAGEN
14
11.2.3
BAKTERIENSTAEMME
14
II
2.4
EUKARYONTISCHE
ZELLEN
15
11.2
5
PLASMIDE
15
II.
2
6
ANTIKOERPER
16
11.2.7
WEITERE
MATERIALIEN
16
11.3
ZUSAMMENSETZUNG
DER
VERWENDETEN
MEDIEN,
PUFFER
UND
LOESUNGEN
16
11.3.1
MEDIEN
16
II.
3.2
ALLGEMEINE
PUFFER
UND
LOESUNGEN
17
11.4
MIKROBIOLOGISCHE
METHODEN
18
114.1
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
18
11.4
2
TRANSFORMATION
VON
E
COLI
18
11.4.3
PLATTIEREN
VON
PHAGEN
UND
HERSTELLUNG
EINES
PLATTENLYSATES
18
II.4.4
HERSTELLUNG
EINES
PHAGEN-FLUESSIGLYSATES
19
II.
5
KULTIVIERUNG
UND
TRANSFEKTION
EUKARYONTISCHER
ZELLEN
19
11.5
1
KULTIVIERUNG
VON
MENSCHLICHEN
293-ZELLEN
19
115.2
TRANSFEKTION
MENSCHLICHER
293-ZELLEN
19
115.3
KULTUR
EINER
HYBRIDOMA
ZELL-LINIE
20
II
5.4
KULTIVIERUNG
VON
TRYPANOSOMEN
20
11.5
5
TRANSFEKTION
VON
PROZYKLISCHEN
TRYPANOSOMEN
20
11.6
ISOLIERUNGEN
VON
NUKLEINSAEUREN
21
116.1
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
21
116.1.1
MINIPRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
21
11.6
1.2
PLASMID-DNA
PRAEPARATION
DURCH
LONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE
21
11.6.1.3
CSCL
2
-MAXIPRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
21
116
2
ISOLIERUNG
VON
PHAGEN-DNA
21
11.6.3
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
TRYPANOSOMEN
22
II
6.4
ISOLIERUNG
VON
POLYA*-RNA
AUS
GESAMT-RNA
22
II.6
5
PRAEPARATIVE
ISOLIERUNG
VON
DNA-RESTRIKTIONSFRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
22
11.7
REINIGUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
22
INHALTSVERZEICHNIS
11.7.
1
PHENOLEXTRAKTION
22
II.
7.2
ETHANOLFAELLUNG
22
II
7.3
SYNTHESE
UND
REINIGUNG
SYNTHETISCHER
OLIGONUKLEOTIDE
23
11.8
DNA
MODIFIKATIONEN
23
II.8.1
RESTNKTIONSHYDROLYSE
23
H
8.2
RESTRIKTIONSKARTIERUNG
REKOMBINANTER
PHAGEN
23
II
8
3
HERSTELLUNG
VON
DELETIONSKLONEN
23
II.8.4
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
LINEARER
DNA
24
11.8.4.1
YYRANDOM-PRIME
"
MARKIERUNG
24
II
8
4.2
PHOSPHORYLIERUNG
AM
5
-ENDE
24
II
8.4
3
UEBERPRUEFUNG
DER
MARKIERUNGSEFFEZIENZ
RADIOAKTIV
MARKIERTER
SONDEN
24
118.5
DEPHOSPHORYLIERUNG
AM
5
-ENDE
24
11.8.6
PROZESSIERUNG
VON
RESTRIKTIONSSCHNITTSTELLEN
25
II
8.6.1
HERSTELLUNG
VON
STUMPFEN
ENDEN
MIT
KLENOW-ENZYM
25
II
8.6.2
HERSTELLUNG
VON
STUMPFEN
ENDEN
MIT
T4-POLYMERASE
25
II
8.7
DNA-LIGATION
25
II.
8
8
MUTAGENESE
25
11.9
METHODEN
ZUR
IDENTIFIZIERUNG
UND
MOLEKULARBIOLOGISCHEN
ANALYSE
VON
NUKLEINSAEUREN
26
11
9
1
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
26
II
9
2
SEQUENZANALYSE
27
1192
1
FLUORESZENZSEQUENZIERUNG
27
II
9
2.2
RADIOAKTIVE
SEQUENZIERUNG
27
II.9.3
POLYMERASE
KETTENREAKTION
27
119.4
5-PCR
28
H9.5
3-RACE
28
II
.9
6
REVERSE
TRANSKRIPTION
28
11.9.7
DNA-TRANSFER
AUF
NYLON-MEMBRANEN
28
119.8
HYBRIDISIERUNG
VON
DNA
MIT
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
SONDEN
29
119
9
HYBRIDISIERUNG
VON
RNA
MIT
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
SONDEN
29
II
9
10
HYBRID-SELEKTIONIERUNG
VON
CDNA
29
11.9.
1
1
HERSTELLUNG
EINER
GENOMISCHEN
PHAGEN-BANK
30
11.9.12
YYSCREEN
"
EINER
GENOMISCHEN
PHAGEN-BANK
UND
PLAQUEHYBRIDISIERUNG
30
11.10
KLONIERUNG
VON
KONSTRUKTEN
FUER
DIE
PROTEIN-EXPRESSION
31
11.10.1
KLONIERUNG
VON
KONSTRUKTEN
FUER
DIE
BAKTERIELLE
EXPRESSION
31
11.10.
1
.1
KONSTRUKT
ZUR
BAKTERIELLEN
EXPRESSION
ALS
GST-FUSIONSPROTEIN
(PGEX-BPI)
31
II.
10
1.2
KONSTRUKT
ZUR
BAKTERIELLEN
EXPRESSION
ALS
GST-FUSIONSPROTEIN
(PGEX-PPL)
31
11.10.1
3
KONSTRUKT
ZUR
BAKTERIELLEN
EXPRESSION
ALS
HIS-FUSIONSPROTEIN
(PQE-PPL)
31
II
10.2
KLONIERUNG
VON
KONSTRUKTEN
FUER
DIE
EXPRESSION
IN
HUMANEN
293-ZELLEN
32
11.10
2
1
KONSTRUKT
ZUR
TRANSIENTEN
EXPRESSION
(PSCTEV-TBZFK)
32
11
10.2
2
KONSTRUKT
ZUR
TRANSIENTEN
EXPRESSION
ALS
HA-FUSIONSPROTEIN
(PSCTEV-TBZFKH)
32
II.
10
2.3
KONSTRUKT
ZUR
EXPRESSION
DER
KATAL
DOMAENE
VON
TBZFK
ALS
HA-FUSIONSPROTEIN
(PEV-CATH)
32
II
10.2.4
KONSTRUKT
ZUR
EXPRESSION
DER
KATAL
UND
CARBOXYTERM
DOMAENE
VON
TBZFK
ALS
HA-FUSIONS
PROTEIN
(PEV-CATH;
PEV-CCATH)
33
II
10.2
5
KONSTRUKT
ZUR
STABILEN
EXPRESSION
VON
TBZFK
ALS
HA-FUSIONSPROTEIN
(PCEP-TBZFK)
33
II.
10.3
KLONIERUNG
VON
KONSTRUKTEN
FLLR
DIE
EXPRESSION
IN
PROZYKLISCHEN
TRYPANOSOMEN
33
11.10
3.1
KONSTRUKT
ZUR
EXPRESSION
VON
LUZIFERASE
(PTSO-LUC)
33
11.10.3.2
KONSTRUKT
ZUR
EXPRESSION
VON
YYGREEN
FLUORESCENT
PROTEIN
"
(PTSO-GFP)
33
II
10.3.3
KONSTRUKT
ZUR
EXPRESSION
VON
TBZFK
ALS
HA-FUSIONSPROTEIN
(PTSO-TBZFKH)
33
II.
10
3.4
KONSTRUKT
ZUR
EXPRESSION
DER
KATALYTISCHEN
DOMAENE
VON
TBZFK
ALS
HA-FUSIONSPROTEIN
(PTSO
CATH)
34
II.
10.4
SCHEMATISCHE
UEBERSICHT
UEBER
DIE
EXPRESSIONS-KONSTRUKTE
35
11.11
METHODEN
ZUR
IDENTIFIZIERUNG
UND
MOLEKULARBIOLOGISCHEN
ANALYSE
VON
PROTEINEN
36
11.11.1
QUANTIFIZIERUNG
VON
PROTEINEN
36
11.11
1.1
YYBRADFORD
"
-PROTEINBESTIMMUNG
36
INHALTSVERZEICHNIS
11
11.1
2
AMIDOSCHWARZ-PROTEINBESTIMMUNG
36
11.11.1
3
YYLOWRY
"
-PROTEINBESTIMMUNG
36
II.
11
14
PROTEINBESTIMMUNG
DURCH
ABSORPTIONSMESSUNG
36
II.
11
2
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
36
II.
11.3
ELEKTROELUTION
VON
PROTEINEN
37
11114
ZINK-BESTIMMUNG
IN
PROTEINLOESUNGEN
37
11.11
5
FAERBUNG
VON
PROTEINEN
IM
SDS-POLYACRYLAMIDGEL
37
II
11.6
WESTEM-BLOT-ANALYSE
38
11.11.7
HERSTELLUNG
EINES
POLYKLONALEN
ANTISERUMS
38
II.
II
8
AFFMITAETSREINIGUNG
EINES
POLYKLONALEN
ANTISERUMS
38
11.11.9
EXPRESSION
VON
GST-FUSIONSPROTEINEN
IN
E
COLI
39
II
11.10
REINIGUNG
VON
GST-FUSIONSPROTEINEN
39
II.
11.11
EXPRESSION
VON
HIS-FUSIONSPROTEINEN
IN
E.COLI
40
11
11.12
REINIGUNG
VON
HIS-FUSIONSPROTEINEN
40
11.11
13
EXPRESSION
VON
HA-FUSIONSPROTEINEN
IN
SAEUGERZELLEN
40
II.
11.14
REINIGUNG
VON
HA-FUSIONSPROTEINEN
40
II.
11.15
HERSTELLUNG
VON
PROTEINEXTRAKTEN
AUS
T
BRUCEI
41
11.12
ENZYMTESTS
41
11.12
1
KINASE-AKTIVITAETSTEST
41
II
.
12.2
AUTOPHOSPHORYLIERUNGSTEST
42
II
12.3
LUZIFERASE-AKTIVITAETSTEST
42
III.
ERGEBNISSE
43
III.
1
GENOMISCHE
KLONIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
EINER
PROTEINKINASE
BEI
T.
BRUCEI
43
III.
1.1
VORARBEITEN
UND
STRATEGIE
DER
ARBEIT
43
111
1.2
HERSTELLUNG
UND
YYSCREEN
"
EINER
GENOMISCHEN
PHAGEN-BANK
43
III
1.3
RESTRIKTIONSKARTIERUNG
DER
PHAGEN-KLONE
43
111
1.4
GENOMISCHE
ORGANISATION
VON
TBZFK
44
III.
1.5
CHROMOSOMALE
LOKALISATION
VON
TBZFK
45
III.
1.6
SEQUENZIERUNG
47
III.
1.7
IDENTIFIZIERUNG
DER
TRANS-SPLEISSSTELLE
UND
DER
POLYADENYLIERUNGSSTELLE
VON
TBZFK
50
III.
1.7
1
IDENTIFIZIERUNG
DER
TRANS-SPLEISSSTELLE
50
III.
1.7
2
IDENTIFIZIERUNG
DER
POLYADENYLIERUNGSSTELLE
51
III
1
8
SEQUENZANALYSE
52
III.
1.9
SUCHE
NACH
VERWANDTEN
GENEN
56
III.
I
10
MRNA-EXPRESSION
VON
TBZFK
57
III.
2
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
PROTEINSYNTHESE
VON
TBZFK
58
III
2
1
HERSTELLUNG
SPEZIFISCHER
ANTIKOERPER
58
I1I.2.I
1
BAKTERIELLE
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
DER
GST-FUSIONSPROTEINE
GST-BP1/PP1
58
III.
2
1
2
BAKTERIELLE
EXPRESSION
UND
REINIGUNG
DES
FUSIONSPROTEINS
HIS-PPI;
SPEZIFITAET
DER
AFFMITAETSGEREINIGTEN
ANTIKOERPER
60
III
2.2
OPTIMIERUNG
DER
WESTEM-BLOT
BEDINGUNGEN
61
III
2
3
EXPRESSION
VON
TBZFK
62
III.2.4
QUANTITATIVE
BESTIMMUNG
DER
TBZFK-EXPRESSION
64
1
11.3
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
ZINK-BINDUNG
DER
CYSTEINREICHEN
DOMAENE
64
1113
1
HERSTELLUNG
UND
EXPRESSION
VON
MUTANTEN
DER
CYSTEINREICHEN
DOMAENE
64
III.
3
2
BESTIMMUNG
DER
ZINK-BINDUNG
MITTELS
ATOM-ABSORPTIONS-SPEKTROSKOPIE
66
111.4
HETEROLOGE
EXPRESSION
UND
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
AKTIVITAET
VON
TBZFK
68
1114
1
TRANSIENTE
EXPRESSION
VON
TBZFK
IN
293-ZELLEN
68
HL
4
2
TRANSIENTE
EXPRESSION
VON
TBZFK
ALS
FUSIONSPROTEIN
IN
293-ZELLEN
69
1114
3
AFFMITAETSREINIGUNG
VON
TBZFK
NACH
EXPRESSION
IN
293-ZELLEN
70
III
4.4
KINASE-AKTIVITAET
VON
TBZFK
NACH
EXPRESSION
IN
293-ZELLEN
72
II
1.4.5
AUTOPHOSPHORYLIERUNG
VON
TBZFK
NACH
EXPRESSION
IN
293-ZELLEN
111.4.6
STABILE
EXPRESSION
VON
TBZFK
IN
293-ZELLEN
74
75
III.S
HOMOLOGE
UEBEREXPRESSION
UND
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
AKTIVITAET
VON
TBZFK
76
111.5.1
TRANSFEKTION
VON
PROZYKLISCHEN
TRYPANOSOMEN
76
III.5.2
UEBEREXPRESSION
VON
TBZFK
IN
TRYPANOSOMEN
77
III
5.3
EINFLUSS
DER
TBZFK-UEBEREXPRESSTON
AUF
DIE
KULTIVIERUNG
VON
PROZYKLISCHEN
TRYPANOSOMEN
79
111.5.4
KINASE-AKTIVITAET
VON
TBZFK
79
111.5.4.1
AFFINITAETSREINIGUNG
VON
TBZFK
79
111.5
4.2
KINETIK
DER
KINASE-AKTIVITAET
80
II1.5.4.3
SUBSTRATSPEZIFITAET
VON
TBZFK
81
III
5
4
4
ABHAENGIGKEIT
DER
KINASE-AKTIVITAET
VON
DER
LONENKONZENTRATION
82
III
5.4.5
PHOSPHOLIPID-STIMULIERBARKEIT
UND
INHIBITION
DER
KINASE-AKTIVITAET
83
111.5.5
AUTOPHOSPHORYHERUNG
VON
TBZFK
NACH
EXPRESSION
IN
TRYPANOSOMEN
84
IV.
DISKUSSION
86
IV
1
SEQUENZANALYSE
86
IV.2
STRUKTUR
UND
FUNKTION
VON
ZINK-FINGER
PROTEINEN
90
IV.3
KINASE-AKTIVITAET
VON
TBZFK
93
1V.4
MOEGLICHE
ROLLE
VON
TBZFK
FUER
DIE
DIFFERENZIERUNG
VON
TRYPANOSOMEN
94
IV.
5
AUSBLICK
95
V.
ZUSAMMENFASSUNG
97
VI.
LITERATURVERZEICHNIS
98
VII.
ANHANG
114
VII
L
SEQUENZEN
DER
VERWENDETEN
PRIMER
H4
VII.
2
UEBERSICHT
UEBER
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SEQUENZIERTEN
DELETIONSKLONE
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