Sulfotransferasen: Isolierung, biochemische und molekularbiologische Charakterisierung
Gespeichert in:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1995
|
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| Beschreibung: | Köln, Univ., Diss., 1995 |
| Beschreibung: | 124 S. Ill., graph. Darst. |
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1
EINLEITUNG
.
1
1.1
SULFOTRANSFERASEN
.
1
1.1.1
BEDEUTUNG
DER
SULFATIERUNG
FUER
DEN
ORGANISMUS
.
1
1.1.2
DIE
CEREBROSID-SULFOTRANSFERASE
.
6
1.1.2.1
VORKOMMEN
UND
BEDEUTUNG
DES
3-SULFO-GALAKTOSYLCERAMID
.
6
1.1.2.2
BIOSYNTHESE
DER
SULFATIDE
.
7
1.1.2.3
DIE
CEREBROSID-SULFOTRANSFERASE
.
9
1.1.3
CYTOSOLISCHE
SULFOTRANSFERASEN
.
12
1.1.3.1
SUBSTRATE
DER
ARYLSULFOTRANSFERASEN
.
13
1.1.3.2
EIGENSCHAFTEN
DER
ARYLSULFOTRANSFERASEN
.
15
2
PROBLEMSTELLUNG
.
18
3
ERGEBNISSE
.
19
3.1
REINIGUNG
DER
CEREBROSID-SULFOTRANSFERASE
.
19
3.1.1
EINFUEHRUNG
.
19
3.1.2
CHEMISCHE
SYNTHESEN
.
19
3.1.2.1
SUBSTRATSYNTHESEN
.
20
3.1.2.2
SYNTHESEN
DER
SUBSTRATDERIVATE
MIT
FUNKTIONELLEN
GRUPPEN
.
22
3.1.3
BESTIMMUNG
DER
CEREBROSID-SULFOTRANSFERASE-AKTIVITAET
.
25
3.1.4
MEMBRANPRAEPARATION
UND
SOLUBILISIERUNG
DES
ENZYMS
.
26
3.1.5
CHARAKTERISIERUNG
DER
CEREBROSID-SULFOTRANSFERASE
.
27
3.1.6
REINIGUNG
DER
CST
.
28
3.1.6.1
LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
.
28
3.1.6.2
FARBSTOFF-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
30
3.1.6.3
HYDROPHOBE
INTERAKTIONSCHROMATOGRAPHIE
.
31
3.1.6.4
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
AN
LECTINEN
.
33
3.1.6.5
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
AN
IMMOBILISIERTEN
(CO-)SUBSTRATEN
.
33
3.1.6.5.1
CHROMATOGRAPHIE
AN
IMMOBILISIERTEM
SUBSTRAT
.
34
3.1.6.5.2
CHROMATOGRAPHIE
AN
IMMOBILISIERTEN
INHIBITOREN
.
35
3.1.7
KOMBINATION
DER
CHROMATOGRAPHIEMETHODEN
.
37
3.2
ISOLIERUNG,
KLONIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
EINER
CEREBRALEN
SULFOTRANSFERASE
VON
MAUS
UND
RATTE
.
42
3.2.1
EINFUEHRUNG
.
42
3.2.2
KLONIERUNG
DER
RATTEN-HIRN-CDNA
.
44
3.2.2.1
ISOLIERUNG
EINES
FRAGMENTES
DURCH
PCR
.
44
3.2.2.2
SCREENING
EINER
RATTEN-HIRN-CDNA-BANK
.
45
3.2.2.3
NORTHERN
BLOT
.
47
3.2.3
KLONIERUNG
DER
MAUS-NIEREN-CDNA
.
47
3.2.3.1
SCREENING
EINER
MAUS-NIEREN-BANK
.
47
3.2.3.2
DIE
CDN
A
DER
RENALEN
SULFOTRANSFERASE
AUS
MAUS
.
48
3.2.4
VERVOLLSTAENDIGUNG
DER
RATTENSEQUENZ
DURCH
RT-PCR
.
50
3.2.5
HOMOLOGIEVERGLEICH
.
54
3.2.6
MOLEKULARBIOLOGISCHE
STUDIEN
.
57
3.2.6.1
ANALYSE
DER
GESCHLECHTS
UND
GEWEBESPEZIFITAET
DURCH
NORTHERN
BLOTTING
.
58
3.2.OE.2
IN
SITU-HYBRIDISIERUNG
.
59
3.2.6.3
FUNKTIONELLE
EXPRESSION
.
61
3.2.6.3.1
KONSTRUKT
.
61
3.2.6.3.2
EXPRESSION
IN
PGEX-3X
.
62
3.2.63.3
EXPRESSION
IN
PET8C
.
63
3.2.7
CHARAKTERISIERUNG
DES
PROTEINS
ALS
ARYLSULFOTRANSFERASE
IV
.
65
3.2.8
HERSTELLUNG
VON
POLYKLONALEN
ANTIKOERPERN
.
67
3.2.8.1
PEPTIDSYNTHESE
.
67
3.2.8.2
IMMUNISIERUNG
.
70
3.2.8.3
ELISA
.
70
3.2.8.4
REINIGUNG
DER
ANTIKOERPER
.
71
3.2.9
IMMUNOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
.
72
3.2.9.1
WESTERN-BLOT
.
72
3.2.9.2
IMMUNPRAEZIPITATION
.
73
4
ZUSAMMENFASSUNG
.76
5
DISKUSSION
.
78
6
EXPERIMENTELLER
TEIL
.
84
6.1
METHODEN
.
84
6.1.1
CHEMISCHE
SYNTHESEN
.
84
6.1.1.1
SYNTHESE
DER
CEREBROSIDE
MIT
N-ACYLRESTEN
VERKUERZTER
KETTENLAENGE.
84
6.1.1.2
SYNTHESE
DES
OZONOLYSIERTEN
SUBSTRATES
.
85
6.1.1.3
SYNTHESE
VON
O-AMINOLAUROYL-CEREBROSID
.
87
6.1.2
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
.
88
6.1.2.1
MIKROSOMENPRAEPARATION
1371
UND
SOLUBILISIERUNG
DES
ENZYMS
.
88
6.1.2.2
MESSUNG
DER
ENZYMATISCHEN
AKTIVITAET
DER
CST
.
88
6.1.2.3
MESSUNG
DER
ENZYMATISCHEN
AKTIVITAET
DER
ARYLSULFOTRANSFERASEN
.
89
6.1.2.4
IMMOBILISIERUNG
DER
(CO)SUBSTRATE
AN
DER
MATRIX
.
89
6.1.2.5
REINIGUNG
DER
CEREBROSID-SULFOTRANSFERASE
.
90
6.1.3
PEPTIDSYNTHESE
.
93
6.1.4
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
.
96
6.1.4.1
GEWINNUNG
VON
POLYKLONALEN
ANTIKOERPERN
.
96
6.1.4.2.
ELISA
.
97
6.1.4.3
WESTEM-BLOT
.
98
6.1.4.4
IMMUNPRAEZIPITATION
.
98
6.1.5
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
99
6.1.5.1
PCR
.
99
6.1.5.2
RT-PCR
.
99
6.1.5.3
OLIGONUKLEOTIDSYNTHESE
UND
REINIGUNG
.
100
6.1.5.4
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
.100
6.1.5.5
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.100
6.1.5.6
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
101
6.1.5.7
SCREENING
.
101
6.1.5.8
PLASMID-PRAEPARATIONEN
.
101
6.1.5.9
DNA-SEQUENZIERUNG
.
102
6.1.5.10
NORTHERN-BLOT-ANALYSE
.102
6.1.5.11
EXPRESSION
DER
TYROSINESTERSULFOTRANSFERASE
.102
6.2
MATERIALIEN
.
103
RADIOAKTIVE
ISOTOPE
.
103
IMMUNOCHEMISCHE
REAGENTIEN
.
103
CHROMATOGRAPHISCHE
MATERIALIEN
.104
ENZYME
.
104
KITS
.104
MEMBRANEN
.104
GERAETE
.105
6.3
IM
TEXT
VERWENDETE
ABKUERZUNGEN
.
105
7
ANHANG
.
107
8
LITERATUR
.
108 |
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