Isolierung und Kartierung von chromosomenspezifischen Mikrosatelliten beim Schwein:
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Kiel
Inst. für Tierzucht und Tierhaltung
1996
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| Series: | Institut für Tierzucht und Tierhaltung <Kiel>: Schriftenreihe des Instituts für Tierzucht und Tierhaltung der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel
89 |
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VERZEICHNIS
DER
ABKUERZUNGEN
VERZEICHNIS
DER
ABBILDUNGEN
VERZEICHNIS
DER
TABELLEN
VERZEICHNIS
DER
UEBERSICHTEN
SEITE
1
EINLEITUNG
1
2
LITERATURUEBERSICHT
3
XI
GENETISCHE
MARKER
3
22
MIKROSATELLITEN
7
22.1
DEFINITION
7
22.2
EINTEILUNG
S
2.2.3
VORKOMMEN
8
2.2.4
POLYMORPHISMUS
9
2.2.5
ASSOZIATION
DER
(GT),-REPEATS
MIT
ANDEREN
MIKROSATELLITENSEQUENZEN
10
2.2.6
ASSOZIATION
DER
MIKROSATELLITEN
MIT
SINE-SEQUENZEN
11
2.2.7
HERKUNFT
UND
FUNKTIONELLE
BEDEUTUNG
12
22.8
DARSTELLUNG
VON
MIKROSATELLITENPOLYMORPHISMEN
13
23
GENKARTIERUNG
14
2.3.1
GENETISCHE
KARTIERUNG
15
2.3.2
PHYSIKALISCHE
KARTIERUNG
17
2.3.3
STAND
DER
GENKARTIERUNG
19
X4
ERSTELLUNG
EINER
GENBIBLIOTHEK
21
X5
MIKROSATELLITENISOLIERUNG
22
2.5.1
ZUFAELLIGE
ISOLIERUNG
VON
MIKROSATELLITEN
22
2.5.2
CHROMOSOMENSPEZIFISCHE
ISOLIERUNG
VON
MIKROSATELLITEN
24
X6
KLONIERUNGSSTRATEGIEN
31
3
MATERIAL
UND
METHODEN
34
3.1
MATERIAL
34
3.1.1
CHEMIKALIEN
34
3.12
ENZYME
UND
KITS
34
3.1.3
PRIMER
UND
DNTPS
35
3.1.4
PUFFER
UND
STAMMLOSUNGEN
36
3.1.5
VEKTOREN,
E.
CO/I-STAEMME
UND
DNA-BIBLIOTHEK
36
3.1.6
GERATE
UND
VERBRAUCHSMATERIAL
37
3.1.7
RASSENPANEL
UND
REFERENZFAMILIEN
38
3.1.8
COMPUTERPROGRAMME
UND
DATENBANKEN
38
3.1.9
AUSGANGSMATERIAL
FUER
DIE
CHROMOSOMENSORTIERUNG
39
3.2
PRAEPARATIAN
DES
CHROMOSOMENSPEZLFLSCHEN
MATERIALS
39
3.2.1
DURCHFLUSSCYTOMETRIE
39
3.2.2
PROTEINASE-K-REAKTION
DES
SORTIERTEN
MATERIALS
40
3.3
STRATEGIEN
ZUR
ERSTELLUNG
EINER
CHROMOSOMENSPEZIFISCBEN
BIBLIOTHEK
40
3.3.1
STRATEGIEN
UNTER
VERWENDUNG
VON
1000
CHROMOSOMEN
ALS
AUSGANGSMATERIAL
41
3.3.1.1
PARM-PCR
42
3.3.1.2
PCR
MIT
CHROMOSOMENSPEZIFISCHEN
PRIMERN
ZUR
UEBERPRUEFUNG
DER
SORTIERUNGSGENAUIGKEIT
43
3.3.1.3
FRAGMENTGROESSENSELEKTION
IN
PRAEPARATIVEN
AGAROSEGELEN
(VORVERSUCH
B)
44
3.3.1.4
LIGATION
DER
PCR-FRAGMENTE
IN
EINEN
VEKTOR
(VORVERSUCHE)
45
3.3.1.5
TRANSFORMATION
(VORVERSUCHE)
46
3.3.1.6
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
DER
PCR-FRAGMENTE
47
3.3.1.7
MASKIERUNG
DER
PCR-FRAGMENTE
MIT
GENOMISCHER
DNA
48
3.3.1.8
HYBRIDISIERUNG
EINER
COSMIDBIBLIOTHEK
MIT
CHROMOSOMENSPEZIFISCHER
SONDE
52
3.3.1.9
MINIPRAEPARATION
DER
COSMIDKLONE
53
3.3.1.10
SOUTHERN
BLOT
UND
REHYBRIDISIERUNG
54
3.3.1.11
SUBKLONIENMG
DER
COSMIDKLONE
56
3.3.2
STRATEGIE
UNTER
VERWENDUNG
VON
10000
CHROMOSOMEN
ALS
AUSGANGSMATERIAL
57
3.3.2.1
RESTRIKTIONSABBAU
DER
GENOMISCHEN
DNA
58
3.3.2.2
LIGATION
DER
DNA-FRAGMENTE
IN
EINEN
VEKTOR
58
3.3.2.3
PCR
MIT
UNIVERSALPRIMEM
DES
VEKTORS
59
3.3.2.4
RESTRIKTIONSVERDAU
UND
SAEULENREINIGUNG
DER
PCR-FRAGMENTE
59
3.3.2.S
LIGATION
DER
PCR-FRAGMENTE
IN
EINEN
VEKTOR
(HAUPTVERSUCH
2)
60
3.3.2.6
TRANSFORMATION
(HAUPTVERSUCH
2)
61
3.4
HYBRIDISIERUNG
DER
CHROMOSOMENSPEZIFISCHEN
BIBLIOTHEKEN
MIT
SYNTHETISCHEN
OLIGONUKLEOTIDEN
61
3.4.1
KOLONIE-TRANSFER
AUF
NYLONMEMBRANE
61
3.4.2
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
DER
SONDEN
61
3.4.3
HYBRIDISIERUNG
DER
DNA
62
3.5
MINIPRAEPARATION
DER
PLASMIDKLONE
63
3.6
SEQUENZIERUNG
DER
DNA
63
3.6.1
SEQUENZIERUNG
DOPPELSTRAENGIGER
PLASMID-DNA
64
3.6.2
CYCLE-SEQUENZIERUNG
64
3.6.3
DENATURIERENDE
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
65
3.6.4
AUSWERTUNG
DER
SEQUENZDATEN
65
3.7
ANALYSE
DER
MIKROSATELLITENLOCI
65
3.7.1
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
66
3.7.2
PCR
UND
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
66
3.7.3
DARSTELLUNG
DER
PCR-PRODUKTE
MIT
HILFE
DER
SILBEMITRATFTRBUNG
68
3.7.4
DARSTELLUNG DER
PCR-PRODUKTE
MIT
HILFE
EINER
AUTOMATISCHEN
DNA-SEQUENZIEREINRICHTUNG
68
3.7.5
BESTIMMUNG
DER
FRAGMENTLAENGEN
68
3.7.6
BERECHNUNG
DER
ALLELFIEQUENZEN
69
3.7.7
KOPPLUNGSANALYSE
69
3.7.8
IN
RIRU-HYBRIDISIERUNG
69
4
ERGEBNISSE
71
4.1
SORTIERUNG
DER
CHROMOSOMEN
UND
UEBERPRUEFUNG
DER
SORTIERUNGSGENAUIGKEIT
71
4.2
KTONIERUNGSEFFIZIENZEN
74
4.3
MIKROSATELLITENISOLIERUNG
AUS
CHROMOSOMENSPEZLFLSCHEN
BIBLIOTHEKEN
75
4.3.1
MIKROSATELLITENISOLIERUNG
AUS
1000
SORTIERTEN
CHROMOSOMEN
76
4.3.2
MIKROSATELLITENISOLIERUNGAUS
10000
SORTIERTEN
CHROMOSOMEN
84
4.4
SEQUENZIERUNG
84
4.5
CHARAKTERISIERUNG
DER
MIKROSATELLITEN
92
4.5.1
EINTEILUNG
DER
MIKROSATELLITEN
93
4.5.2
ASSOZIATION
DER
MIKROSATELLITEN
MIT
SINE-SEQUENZEN
SOWIE
MIT
ANDEREN
MIKROSATELLITEN
94
4.5.3
AUSWAHL
DER
MIKROSATELLITEN
FUER
DIE
FRAGMENTANALYSE
96
4.5.4
FRAGMENTANALYSE
DER
PCR-PRODUKTE
AUS
MIKROSATELLITENLOCI
100
4.5.4.I
FRAGMENTANALYSE
DER
PCR-PRODUKTE
MIT
HILFE
DER
SILBEMITRATFAERBUNG
101
4.5.4.2
FRAGMENTANALYSE
DER
PCR-PRODUKTE
MIT
HILFE
EINER
AUTOMATISCHEN
SEQUENZIEREINRICHTUNG
102
4.6
ALLELFREQUENZEN
AN
DEN
UNTERSUCHTEN
MIKROSATELLITENLOCI
106
4.7
KOPPLUNGSANALYSE
107
4.8
IN-^ZTU-HYBRIDISIERUNG
108
4.9
GENKARTE
109
5
DISKUSSION
112
5.1
AUSGANGSMATERIAL
FUER
DIE
ERSTELLUNG
EINER
CHROMOSOMENSPEZIFISCHEN
BIBLIOTHEK
113
5.2
UEBERPRUEFUNG
DER
SORTIERUNGSGENAUIGKEIT
113
5.3
STRATEGIEN
ZUR
ERSTELLUNG
EINER
CHROMOSOMENSPEZIFISCHEN
BIBLIOTHEK
115
5.4
EINSATZ
VON
PARM-PCR
ZUR
AMPLLFIZIERUNG
DES
SORTIERTEN
MATERIALS
119
5.5
ANALYSE
DER
MIKROSATELLITENLOCI
120
5.6
TECHNIKEN
ZUR
DARSTELLUNG
EINZELNER
MIKROSATELLITENLOCI
123
5.7
KOPPLUNGSANALYSE
UND
GENKARTE
126
5.8
SCHLNDFOLGERUNGEN
127
6
ZUSAMMENFASSUNG
131
7
SUMMARY
133
8
LITERATURVERZEICHNIS
135
9
ANHANG
153 |
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