Studien zum Kristallisationsverhalten von Proteinvarianten des Elongationsfaktors Tu aus Thermus thermophilus sowie zur Bindungskinetik natürlicher und nichtnatürlicher Nukleotide:
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|---|---|
| Format: | Thesis Book |
| Language: | German |
| Published: |
1996
|
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| Online Access: | Inhaltsverzeichnis |
| Physical Description: | VIII, 100 S. Ill., graph. Darst. |
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
.
I
ABKUERZUNGEN
.
V
1.
EINLEITUNG
.
1
1.1.
DIE
PROTEINBIOSYNTHESE
IN
PROKARYONTEN.
1
1.2.
EIGENSCHAFTEN
UND
FUNKTION
DER
ELONGATIONSFAKTOREN
TU,
TS
UND
G
.
2
1.2.1.
KLASSIFIZIERUNG
DER
GTP/GDP-BINDENDEN
PROTEINE
.
2
1.2.2.
DIE
ELONGATIONSFAKTOREN:
EF-TU
UND
EF-G
.
3
1.2.3.
AUFGABEN
DES
EF-TU
IN
DER
PROTEINBIOSYNTHESE
.
3
1.2.3.1.
WECHSELWIRKUNG
MIT
GUANOSINNUKLEOTIDEN
UND
EF-TS
.
3
1.2.3.2.
WECHSELWIRKUNG
MIT
AMINOACYL-TRNA
UND
DEM
RIBOSOM
.
5
1.2.4.
DIE
DREIDIMENSIONALE
STRUKTUR
DES
EF-TU
.
6
1.3.
KRISTALLISATION
VON
EF-TU
UND
EF-G
.
7
1.3.1.
STABILITAET
DER
KOMPLEXE
.
7
1.3.2.
VERWENDUNG
VON
NICHTHYDROLYSIERBAREN
NUKLEOTIDANALOGA
.
8
1.3.3.
CHARAKTERISIERUNG
DER
PROTEIN-NUKLEOTID-WECHSELWIRKUNG
.
8
1.3.4.
KRISTALLISATION
VON
ELONGATIONS&KTOREN
.
9
1.4.
EF-TU-VARIANTEN
ZUR
UNTERSUCHUNG
DER
STRUKTUR-FUNKTIONSBEZIEHUNGEN
.
11
1.4.1.
DIE
EF-TU(GLU55LEU)-VARIANTE
.
11
1.4.2.
DIE
EF-TU(ARG59THR)-VARIANTE
.
12
1.4.3.
DIE
EF-TU(THR62ALA)-VARIANTE
.
12
1.4.4.
DIE
EF-TU(HIS67ALA)-VARIANTE
.
12
1.4.5.
AUSTAUSCH
DER
AMINOSAEURE
HISTIDIN
85
IN
EF-TU
.
13
1.4.5.1.
DIE
EF-TU(HIS85GLN)-VARIANTE
.
13
1.4.5.2.
DIE
EF-TU(FFIS85LEU)-VARIANTE
.
13
1.4.6.
DIE
G-DOMAENE
.
14
2.
PROBLEMSTELLUNG
.
15
3.
MATERIALIEN
UND
METHODEN
.
16
3.1.
ALLGEMEIN
VERWENDETE
GERAETE
.
16
3.2.
PROTEINE
UND
CHEMIKALIEN
.
17
3.2.1.
PROTEINE
UND
PEPTIDE
.
17
3.2.2.
CHEMIKALIEN
.
17
3.2.3.
RADIOCHEMIKALIEN
UND
MATERIALIEN
ZUR
DETEKTION
VON
RADIOAKTIVITAET
.
17
3.2.4.
MATERIALIEN
FUER
DIE
CHROMATOGRAPHIE
.
17
3.2.4.1.
STATIONAERE
PHASEN
.
17
3.2.4.2.
MOBILE
PHASEN
.
18
3.2.5.
CHEMIKALIEN
FUER
DIE
GELELEKTROPHORESE
.
18
3.2.6.
MATERIALIEN
FUER
DIE
KRISTALLISATION
.
18
3.2.7.
SONSTIGES
.
18
33.
STANDARDMETHODEN
.
19
3.3.1.
ABSORPTIONSMESSUNG
.
19
3.3.2.
KONZENTRATIONSBESTIMNRUNG
VON
PROTEINEN
.
19
3.3.3.
POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
VON
PROTEINEN
.
19
3.3.3.1.
DENATURIERENDE
GELELEKTROPHORESE
NACH
LAEMMLI
(1970)
.
19
3.3.3.2.
DENATURIERENDE
GELELEKTROPHORESE
NACH
SCHAEGGER
UND
VON
JAGOW
(1987)
.20
3.3.3.3.
PROTEIN-FAERBUNG
.
20
3.3.3.4.
DENATURIERENDE
GELELEKTROPHORESE
MIT
DEM
"PHASTSYSTEM"
.
21
3.3.4.
KONZENTRIEREN
VON PROTEINLOESUNGEN
.
21
3.3.5.
ANALYTIK
VON
NUKLEOTIDEN
.
21
3.3.5.1.
HPLC-ANALYSEN.
.
21
3.3.5.1.1.
GUANOSIN
UND
ADENOSIN-NUKLEOTIDE
.
21
3.3.5.1.2.
MANT-GUANOSIN-NUKLEOTIDE
UND
CAGED-GTP
.
22
3.3.5.2.
DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE
VON
NUKLEOTIDEN
.
22
3.3.6.
BESTIMMUNG
DER
NUKLEOTIDBINDUNGSAKTIVITAET
VON
EF-TU.,
.
;
.
22
3.3.7.
REINIGUNG
VON
NUKLEOSIDTRIPHOSPHATEN
.
23
3.4.
ISOLIERUNG
DES
T.
TFTERMOP/IIZUS-ELONGATIONSFAKTORS
TU
AUS
COZI-ZELLEN
.
23
3.4.1.
VORKULTUREN
.
23
3.4.2.
HAUPTKULTUR
.
24
3.4.3.
ZELLAUFSCHLUSS
.
24
3.4.4.
ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
.
24
3.4.5.
GELPERMEATIONSCHROMATOGRAPHIE
.
24
3.5.
NUKLEOTIDENTFERNUNG
BZW.
AUSTAUSCH
AN
GTP/GDP-BINDENDEN
PROTEINEN
.
25
3.5.1.
WILDTYP-EF-TU
UND
PROTEINVARIANTEN
(T.
THERMOPHILUS)
.
25
3.5.2.
G-DOMAENE
DESEF-TU
(T.
THERMOPHILUS)
.
25
3.5.3.
EF-G(T
THERMOPHILUS)
.
26
3.6.
KRISTALLISATION
VON
PROTEINEN
.
26
3.6.1.
VORBEREITUNG
DER
PROTEINE
ZUR
KRISTALLISATION
.
26
3.6.1.1.
WILDTYP-EF-TU
UND
PROTEINVARIANTEN
.
26
3.6.1.2.
PROTEINE
ZUR
ANWENDUNG
DER
"SCREENING"-METHODE
.
27
3.6.2.
KRISTALLISATIONSANSAETZE
.
27
3.6.3.
EINSATZ
DER
"SCREENING'-METHODE
.
28
3.6.4.
ANALYSE
DER
KRISTALLE
.
30
3.6.4.1.
HANDHABEN
UND
WASCHEN
DER
KRISTALLE
.
30
3.6.4.2.
PROTEINGEHAH
.
30
3.6.4.2.1.
SDS-PAGE
.
30
3.6.4.2.2.
BRADFORD-PROTEINBESTIMMIMG
.
30
3.6.4.3.
ENTHALTENE
NIEDERMOLEKULARE
VERBINDUNGEN
.
30
3.6.4.3.I.
NUKLEOTIDGEHALT
.
30
3.6.4.3.2.
NACHWEIS
VON
TETRACYCLIN
.
30
3.6.5.
MONTIEREN
DER
KRISTALLE
.
31
3.6.6.
"SOAKING"-EXPERIMENTE
.
31
3.7.
KRISTALLOGRAPHISCHE
DATENSAMMLUNG
.
31
3.8.
DATENVERARBEITUNG
IM
FALL
VON
EF-TU-GPPCHJP
.
32
3.9.
SYNTHESE
VON
3'-(N-METHYL)ANTHRANILOYL-2'-DESOXYGUANOSIN-5'-DIPHOSPHAT
.
33
3.9.1.
REINIGUNG
DES
ROHPRODUKTS
.
33
3.10.
FLUORESZENZSPEKTROSKOPISCHE
UNTERSUCHUNGEN
.
34
3.10.1.
BESTIMMUNG
VON
ASSOZIATIONSGESCHWINDIGKEITEN
.
34
3.10.2.
BESTIMMUNG
VON
DISSOZIATIONSGESCHWINDIGKEITEN
.
34
ERGEBNISSE:
TEIL
I
4.
KRISTALLISATION
DES
ELONGATIONSFAKTORS
TU
.
35
4.1.
KRISTALLISATION
VON
WILDTYP-EF-TU
.
35
4.2.
KRISTALLISATION
VON
EF-TU-VARIANTEN
.
37
4.2.1.
DIE
EF-TU(GLU55LEU)-VARIANTE
.
37
4.2.2.
DIE
EF-TU(ARG59THR)-VARIANTE
.
38
4.2.3.
DIE
EF-TU(THR62ALAYVARIANTE
.
39
4.2.4.
DIE
EF-TU(HIS67ALA)-VARIANTE
.
39
4.2.5.
DIE
EF-TU(HIS85GLN)-VARIANTE
.
41
4.2.6.
DIE
EF-TU(HIS85LEU)-VARIANTE
.
42
4.3.
KRISTALLE
AUS
NATIVEM
EF-TU-GDP
.
43
4.3.1.
KRISTALLISATION
VON
EF-TU-GDP
.
44
4.3.2.
EF-TU-GDP-KRISTALLE
DURCH
NUKLEOTIDAUSTAUSCH
.
45
4.4.
KRISTALLSTRUKTURANALYSE
VON
EF-TU-GPPCHJP
.
47
4.4.1.
DATENSAMMLUNG
UND
PROZESSIERUNG
.
47
4.4.2.
ERSTELLEN
EINER
ELEKTRONENDICHTEVERTEILUNG
.
47
4.4.3.
INTERPRETATION
DER
ELEKTRONENDICHTE
.
48
4.5.
COKRISTALLISATION
VON
EF-TU
MIT
STRUKTURELL
DEM
AMINOACYL-ENDE
DER
TRNA
AEHNLICHEN
VERBINDUNGEN
.
50
4.5.1.
EXPERIMENTE
MIT
ADENOSIN-2',3
,
-CYCLOPHOSPHAT-5'-PHOSPHAT
.
50
4.5.2.
EXPERIMENTE
MIT
TETRACYCLIN
.
50
4.6.
KRISTALLISATION
DES
ELONGATIONSFAKTORS
G
.
51
ERGEBNISSE:
TEIL
II
5.
DISSOZIATIONSKONSTANTEN
VON
EF-TU-NUKLEOTIDKOMPLEXEN.
53
5.1.
FLUORESZENZVERHALTEN
DES
EF-TU
.
54
5.2.
EINSATZ
VON
FLUORESZENZMARKIERTEN
NUKLEOTIDEN
.
55
5.3.
FLUORESZENZ-RESONANZ-ENERGIETRANSFER.
56
5.4.
NUKLEOTIDASSOZIATIONSKINETIK
.
57
5.4.1.
BESTIMMUNG
DER
ASSOZIATIONSRATEN
VON
MANT-NUKLEOTIDEN
.
57
5.4.2.
ASSOZIATION
VON
UNMARKIERTEN
NUKLEOTIDEN
BZW.
NUKLEOTIDANALOGA
.
59
5.4.2.1.
VERFOLGUNG
DER
INTRINSISCHEN
TRYPTOPHANFIUORESZENZ
.
.
59
5.4.2.2.
BESTIMMUNG
DER
NUKLEOTIDASSOZIATION
DURCH
KOMPETITION
MIT
MANTDGDP
.
60
5.4.3.
ASSOZIATION
VON
ADP
AN
NUKLEOTIDFREIEN
EF-TU
.
62
5.4.4.
ASSOZIATION
VON
GDP
UND
GTP
AN
DIE
EF-TU(HIS85
LEU)-VARIANTE
.
63
5.5.
NUKLEOTIDDISSOZIATIONSKINETIK
.
64
5.5.1.
DISSOZIATION
VON
WILDTYP-EF-TU-NUKLEOTID-KOMPLEXEN
.
64
5.5.2.
NUKLEOTIDDISSOZIATION
DER
G-DOMAENE
DES
EF-TU
.
66
5.5.3.
VERHALTEN
VON
PROTEINVARIANTEN
WAEHREND
DER
NUKLEOTIDDISSOZIATION
.
67
5.6.
TERNAERE
KOMPLEXBILDUNG
IN
ANWESENHEIT
EINES
NUKLEOTIDANALOGONS
.
68
6.
DISKUSSION
.
69
6.1.
VOR
UND
NACHTEILE
VERSCHIEDENER
METHODISCHER
ANSAETZE
ZUR
KRISTALLISATION
DES
EF-TU
.
69
6.1.1.
UNTERSCHIEDLICHE
KRISTALLISATIONSBEDINGUNGEN
KOENNEN
ZUR
KRISTALLBILDUNG
FUHREN
.69
6.1.2.
DIE
KRISTALLQUALITAET
VERSCHLECHTERT
SICH
BEI
LAENGEREN
KRISTALLISATIONSZEITEN
.
70
6.1.3.
"SOAKING"
KANN
DIE
QUALITAET
DER
KRISTALLE
VERSCHLECHTERN
.
71
6.2.
ABHAENGIGKEIT
DES
KRISTALLISATIONSVERHALTENS
DES
EF-TU
VON
DER
AMINOSAEURESEQUENZ
UND
DER
ART
DES
NUKLEOTIDS
.
72
6.2.1.
EINFLUSS
VON
AMINOSAEUREAUSTAUSCHEN
AUF
DIE
KRISTALLISIERBARKEIT
DES
EF-TU
.
72
6.2.1.1.
DIE
THERMISCHE
STABILITAET
DES
PROTEINS
BEEINFLUSST
DIE
KRISTALLISIERBARKEIT
.
72
6.2.1.2.
SCHNELLER
NUKLEOTIDAUSTAUSCH
HAT
KEINEN
ENTSCHEIDENDEN
EINFLUSS
AUF
DIE
KRISTALLISATIONSFAHIGKEIT
.
73
6.2.2.
DIE
ABHAENGIGKEIT
DES
KRISTALLISATIONSVERHALTENS
VON
DER
ART
DES
NUKLEOTIDS
.
73
6.3.
KINETISCHE
PARAMETER
DER
NUKLEOTIDBINDUNG
AN
DAS
EF-TU-MOLEKUEL
EINFLUSS
DER
NUKLEOTIDSPEZIFITAET
AUF
DIE
KOMPLEXSTABILITAET
UND
-STRUKTUR
.
75
6.3.1.
BESONDERHEITEN
DER
FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE
AM
EF-TU
.
75
6.3.2.
KEIN
UNTERSCHIED
VON
MANTDGTP
UND
MANTDGDP
IM
BINDUNGSVERHAKEN
GEGENUEBER
DEN
NATUERLICHEN
GUANOSINNUKLEOTIDEN
(GTP/GDP)
.
78
6.3.3.
UNTERSCHIEDE
IM
BINDUNGSVERHALTEN
VERSCHIEDENER
VERWENDETER
NUKLEOTIDE
UND
DEREN
ANALOGA
.
79
6.3.4.
EINFLUSS
DES
NUKLEOTIDANALOGA-EF-TU-KOMPLEXES
AUF
DIE
WECHSELWIRKUNG
MIT
AMINOACYL-TRNA
.
81
6.4.
MECHANISTISCHES
MODELL
FUER DIE
NUKLEOTIDBINDUNG
.
84
7.
ZUSAMMENFASSUNG.
85
8.
SUMMERY
.
87
9.
LITERATURVERZEICHNIS
.
88
10.
ANHANG
.
99
STRUKTURFORMELN
DER
GTP-ANALOGA
.
99
ERKLAERUNG
.
100 |
| any_adam_object | 1 |
| author | Wagner, Annett |
| author_facet | Wagner, Annett |
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| author_sort | Wagner, Annett |
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| discipline | Biologie |
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