Beiträge zur Diagnostik und Pathogenese der Lyme-Borreliose und zur Transmission des Erregers Borrelia burgdorferi:
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Göttingen
Cuvillier
1996
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis Seite I
1 EINLEITUNG UND ZIELE DER ARBEIT 1
2 MATERIAL UND METHODEN 7
2.1 Material 7
2.1.1 Humane Seren, üquor, Synovialflüssigkeit, Urin und Hautbiopsate 7
2.1.2 Zecken 7
2.1.3 Animalische Seren, Gewebeproben und Ohrbiopsate 7
2.1.4 Herkunft der Bakterienstämme 7
2.1.5 Plasmide 8
2.1.6 dna-längenstandards 8
2.1.7 Proteinstandards 9
2.1.8 Enzyme 9
2.1.9 antikörper 9
2.1.10 Chemikalien 10
2.1.11 saulenmaterialien 11
2.1.12 Radiochemikauen 11
2.1.13 nährmedien für die anzucht von e.coli 11
2.1.14 Zusammenstellung des BSK-II-Mediums nach BARBOUR (1984)
zur borrelien-anzucht 12
2.1.15 lösungen und puffer 13
2.2 Xenodiagnose 16
2.3 Anzucht und antigengewinnung von Borrelia ssp. 16
2.3.1 Anzucht von Borrelia burgdorferi und Borrelia hermsii 16
2.3.2 Aufbewahren, Einfrieren und Auftauen der Zellen 16
2.3.3 Antigenaufbereitung 17
2.4 Methoden zur Protein- und Antigenuntersuchung 17
2.4.1 western-blot 17
2.4.1.1 Semi-Dry-Elektroblot 17
2.4.1.2 Naßblot 18
2.4.2 Immunblot-Färbung 18
2.4.3 Elution spezifischer Antikörper (OLMSTED, 1981) 19
2.5 DNA-Konzentrationsbestimmung durch photometrische Analyse 19
2.6 Konzentrierung und Reiniguno von DNA 20
2.6.1 präzipitation mit ethanol 20
2.6.2 präzipitation mit isopropanol 20
2.6.3 Extraktion mit Phenol/Chloroform, Chloroform und Ether 21
2.6.4 ionenaustauschchromatographie mit de 52 21
2.6.5 Molekularsiebchromatographie mit Sephadex G50 22
2.7 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen 22
Inhaltsverzeichnis Seite II
2.8 Elektrophorese-Techniken 23
2.8.1 Agarosegel-Elektrophorese von DNA-Fragmenten 23
2.8.2 Polyacrylamidgel-Elektrophorese 23
2.8.3 Gelelektrophorese für die manuelle Sequenzierung 24
2.8.4 Sequenziergel-Elektrophorese für das DNA-Sequencing System 373A 25
2.8.5 SDS-PAGE 26
2.9 färbung der gele 27
2.9.1 Coomassie-Blau-FArbung 27
2.9.2 Ethidiumbromid-Färbung und Dokumentation der DNA-Gele 27
2.10 Methoden zur Plasmidkonstruktion 27
2.10.1 Amplifikation und Isolierung von Plasmid-DNA aus e.coli 27
2.10.2 DNA-Isolierung aus Agarosegelen 28
2.10.3 Dephosphorylierung von 5 -Enden mit alkalischer Phosphatase 29
2.10.4 Auffüllen von 5 -kohäsiven DNA-Enden mit Hilfe der DNA-Polymerase i 29
2.10.5 llgation mit t4-dna-ügase 30
2.10.6 Transformation von E. coli 31
2.10.6.1 Herstellung kompetenter Zellen 31
2.10.6.2 Transformation von E.coli SURE™ mit Plasmid-DNA 32
2.10.7 In situ-DNA-Hybridisierung (Sambrook et al., 1989) 32
2.10.8 Plasmid-Mini-Isolierung 33
2.10.9 klonierung von pcr-fragmenten 34
2.11 hybridisierungstechniken 35
2.11.1 Nick-Translation (RIGBY et al., 1977) 35
2.11.2 multiprime dna labelling system (amersham, rpn. 1601) 35
2.11.3 Southern-Blot 36
2.11.4 Hybridisierung auf Southern-Blots 37
2.11.5autoradiographie 37
2.12 DNA-Isolierung aus biologischen Materialien 37
2.12.1 Isolierung der genomischen DNA von B.burgdorferi und B.hermsii 37
2.12.2 Aufarbeitung von Zecken (Ixodes ricinus) für die PCR 38
2.12.3 Praparation der DNA aus Serum, Liquor, Urin oder
Synovialflüssigkeit 38
2.12.4 DNA-Isolierung aus Gewebe oder Hautbiopsaten 39
2.13pcr-techniken 39
2.13.1 Auswahl der Primer und Reaktionsbedingungen 39
2.13.2 Synthese und Reinigung der Oligonukleotide 43
2.13.3 Reinigung amplifizierter DNA aus PCR-AnsAtzen 43
2.14 Methoden zur DNA-Sequenzierung 44
2.14.1 Manuelle Sequenzierung (SANGER et al. , 1977) 44
2.14.1.1 Sequenzierung von Plasmid-DNA 44
2.14.1.2 Direktsequenzierung von PCR-Fragmenten 45
2.14.2 Sequenzierung mit dem DNA-Sequencing-System 373A 46
2.14.3 Auswertung der Sequenzdaten 46
Inhaltsverzeichnis Seite III
3 ERGEBNISSE 47
3.1 Genetische Untersuchungen zur Antigenheterogenität von
borrelia burgdorferi 47
3.2 Entwicklung und Optimierung der OspA-PCR 48
3.2.1 Auswahl der Oligonukleotidprimer 49
3.2.2 Empirische Bestimmung der Reaktionsparameter 50
3.2.3 Spezifität und Sensitivität der ospA-PCR 52
3.3 Entwicklung und Optimierung der 16S rDNA-PCR 55
3.3.1 Auswahl der Oligonukleotidprimer 56
3.3.2 Evaluierung der Reaktionsbedingungen 56
3.3.3 Spezifität und Sensitivität der 16S rDNA-PCR 58
3.4 Diagnostische Anwendungen der PCR-Testsysteme und Aspekte zur
stammspezifischen pathogenese 60
3.4.1 prävalenz von borrelia burgdorferi im vektor ixodes ricinus aus dem
Raum Göttingen 60
3.4.2 Neurologische Manifestationen 62
3.4.3 Hautmanifestationen 64
3.4.4 Klonierungen und Sequenzanalysen der Zecken-, Liquor- und
hautbiopsat-spezi fischen ospa- und 16s rdna-pcr-
amplifikationsfragmente von borrelia burgdorferi 65
3.4.4.1 Analysen der ospA-Basensequenzen 65
3.4.4.2 Analysen der OspA-Aminosäuresequenzen 70
3.4.4.3 Analysen der 16S rRNA-Sequenzen 72
3.4.4.4 Einordnung in einen phylogenetischen Kontext 76
3.5 Die Lyme-Borreliose unter internistisch-rheumatologischen Aspekten 78
3.5.1 Die Lyme-Arthritis als Manifestation im Bereich des
Bewegungsapparates 78
3.5.2 Kardiale Manifestationsformen der Lyme-Borreliose 80
3.6 Transmission von Borrelia burgdorferi 82
3.6.1 Reservoirkompetenz des Siebenschläfers (Glis glis) im Kraichgau 83
3.6.1.1 Sequenzanalysen der B.burqdorferi-Isolate 84
3.6.2 Reservoirkompetenz von Apodemus spp. und Rattus norvegicus 85
3.6.2.1 Nachweis von Borrelia burgdorferi 85
3.6.2.2 Molekulare Charakterisierung der B.burodorferi-Isolate 88
3.6.3 Kompetenzvolumen für verbreitete Saugetierwirte von Ixodes ricinus 91
3.6.3.1 Sero- und Genotypanalysen der Borrelia burodorferi-lsolate 93
3.6.4 Borrelia burgdorferi in Europa 94
3.6.4.1 Inzidenz für einen Transmissionszyklus auf Madeira (Portugal) 94
3.6.4.2 Reservoirkompetenz von Rattus spp. und Mus musculus auf Madeira 96
3.6.4.3 Molekulare Analysen der Borrelia burodorferi-lsolate aus Madeira 97
Inhaltsverzeichnis Seite IV
3.7 Charakterisierung von B.burgdorferi in archivierten Zecken-Kollektiven 98
3.7.1 Herkunft und Charakterisierung der Museumsserien 98
3.7.2 Nachweis von Borrelia burgdorferi 99
3.7.3 Molekulare Organisation der archivierten B.burgdorferi-Isolate 101
3.8 Charakterisierung der mitochondrialen 16S rDNA von Ixodes ricinus 103
3.8.1 Konzeption und Entwicklung eines PCR-Assays
zum Nachweis des Gens 103
3.8.2 Nachweis der mitochondrialen 16S rDNA von Ixodes ricinus in alten
Museumsserien 104
3.8.3 Sequenzanalysen der mitochondrialen 16S rDNA 106
3.9 etablierung eines tlermodells zum studium der neuroborreliose 110
3.9.1 Versuchsanordnung 110
3.9.2 Klinische Erscheinungsbilder 112
3.9.3 Humorale Immunantwort der Ratten 112
3.9.4 dlsseminierung und persistenz des erregers im organismus 115
4 DISKUSSION 117
4.1 antigenvarianz bei borrelia spp. 117
4.2 Zur Diagnose der Lyme-Borreliose 120
4.3 stammspezifische pathogenese 136
4.4 die neuroborreliose im tiermodell 139
4.4.1 persistenz und pathogenese 141
4.4.2 Humorale Immunantwort 144
4.5 transmission von borrelia burgdorferi 150
4.6 borrelia burgdorferi in archivierten museumszecken 159
5 ZUSAMMENFASSUNG 162
6 LITERATURVERZEICHNIS 164
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