Superoxid-Dismutase vom Mangan-Typ als Autoantigen bei akuter Epstein-Barr-Virus-Infektion:
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Göttingen
Cuvillier
1996
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis Seite I
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS | |V
ABKÜRZUNGEN V Vlll
1 EINLEITUNG 1
2 MATERIAL UND METHODEN 6
2.1 Material 6
2.1.1 Computer Programme 6
2.1.2 Geräte 6
2.1.3 Chemikalien/Biochemikalien 7
2.1.4 Antikörper 8
2.1.5 Enzyme 9
2.1.6 Proteine allgemein 9
2.1.7 Nukleotide und Nukleinsäuren 9
2.1 8 Säulenmaterialien 10
2.1.9 Verbrauchsmaterialien 10
2.1.10 Seren 10
2.1.11 Lösungen und Puffer 10
2.2 SDS Polyacrylamidgelelektrophorese von Proteinen 11
2.2.1 SDS PAGE unter reduzierenden Bedingungen 12
2.2.2 SDS PAGE unter nicht reduzierenden/teildenaturierenden Bedingungen 12
2.2.3 PAGE unter nativen Bedingungen 12
2.3 Isoelektrische Fokussierung (IEF) von Proteinen 13
2.4 Zweidimensionale Gelelektrophorese 14
2.5 Unspezifische Proteinfärbungen 15
2.5.1 Färbung mit Coomassie Farbstoffnach SDS PAGE 15
2.5.2 Silberfärbung nach SDS PAGE 15
2.5.3 Färbung mit Serva Blau W nach IEF 16
2.6 Transfer von Proteinen auf Membranen (Western Blot) 16
2.6.1 Naßblotverfahren nach SDS PAGE 16
2.6.2 Druckdiffusionsblot nach IEF 17
2.6.3 Dotblot 17
2.7 Immunßrbung nach Western Blot 18
2.7.1.1 Diagnostischer Immunblot 19
2.8 Glykan Machweis 19
2.8.1 Färbung von Glykoproteinen 19
2.8.2 Spezifische Spaltung von N Glykanen 20
2.9 Proteinbestimmung 20
2.10 Entsalzung und Konzentrierung von Proteinen 20
2.10.1 Dialyse 20
Seite II Inhaltsverzeichnis
2.10.2 Gelfiltration 21
2.10.3 Ultraßltration 21
2.11 Superoxid Dismutase(SOD) Aktivitätstest 21
2.11.1 Indirekter SOD Aktivitätstest 21
2.11.2 Hemmung der MnSOD Aktivität in vitro durch Autoantikörper 22
2.11.3NBT Test 23
2.12 Isolierung von Kryoproteinen aus Serum 23
2.13 Anreicherung und Reinigung von MnSOD 24
2.13.1 Isolierung von MnSOD aus menschlichem Gewebe 24
2.13.1.1 Anionenaustauscher Chromatographie 25
2.13.1.2 Hydroxylapatit Chromatographie 25
2.13.1.3 Hydrophobe Interaktions Chromatographie 25
2.13.1.4 Analyse der MnSOD Aufreinigung 26
2.13.2 Isolierung von MnSOD aus menschlichem Serum 26
2.13.2.1 Kopplung des Antikörpers 26
2.13.2.2 Bindung und Elution des Antigens 27
2.14 Bestimmung NH2 terminaler Aminosäuresequenzen 27
2.15 Immunisierung eines Kaninchens 28
2.15.1 Versuchstier und seine Haltung 28
2.15.2 Vorbereitung des zu injizierenden Antigens 28
2.15.3 Immunisierung 28
2.15.4 Gewinnung von Plasma zur Überprüfung des Antikörper Titers 28
2.15.5 Affinitätsreinigung von IgG aus Hyperimmunserum 29
2.16 Immunisierung eines Huhns 29
2.17 Zellkulturverfahren 30
2.17.1 Zellen, Zellinien und Kulturbedingungen 30
2.17.2 Gefrierkonservierung und Auftauen der Zellen 30
2.17.3 Bestimmung von Zellzahl und Zellvitalität 31
2.17.4 Herstellung von Zell Lysaten 31
2.18 B Lymphozytenpräparation aus „Buffy coat 32
2.18.1 Isolierung mononukleärer Zellen (MNL) 32
2.18.2 Positive Selektion von B Lymphozyten aus MNL 32
2.18.3 Durchflußzytometrie (FACS Analysen) 33
2.18.3.1 Bindung fluoreszenz markierter Antikörper an isolierte Zellen 33
2.19 /n v/(ro Infektion von B Lymphozyten mit Epstein Barr Virus (EBV) 34
2.19.1 Anreicherung von Epstein Barr Virus aus Zellkulturüberstand 34
2.19.2 Infektions Experiment 34
2.20 Fluoreszenzmikroskopische Darstellung viraler und zellulärer Antigene 35
2.20.1 Vorbereitung der Objektträger 35
2.20.2 Immunfluoreszenz 35
2.20.2.1 Nachweis von „Early Antigen und „Virus Capsid Antigen durch indirekte
Immunfluoreszenz 35
2.20.2.2 Nachweis von EBV assoziiertem nukleären Antigen und MnSOD durch Antikomplement
Immunfluoreszenz 37
2.21 Affinitätsreinigung von anti MnSOD Antikörpern 37
2.21.1 Herstellung antigenbeschichteter Membranen 3g
2.21.2 Isolierung der Antikörper aus Serum 38
Inhaltsverzeichnis Seite III
2.22 ELISA Tesn erfahren 3g
2.22.1 ELISA zur Quantifizierung von MnSOD 39
2.22.1.1 POD Markierung von anti MnSOD Antikörpem 39
2.22.1.2 Aurreinigung POD konjugierter Antikörper durch Gelpermeations Chromatographie 40
2.22.1.3 Standardbedingungen des MnSOD ELISA 40
2.22.2 ELISA zur Quantifizierung von anti MnSOD Antikörpem 41
2.23 Isolierung von Nukleinsäuren 42
2.23.1 Isolierung von DNA 42
2.23.2 Isolierung von Gesamt RNA 42
2.23.3 Isolierung von poly(A)RNA 43
2.24 cDNA Synthese 43
2.25 Polymerase Kettenreaktion 44
2.26 Gelelektrophorese von Nukleinsäuren 46
2.26.1 Agarose Gelelektrophorese von DNA 47
2.26.2 Agarose Gelelektrophorese von RNA 47
2.27 Sequenzierung von PCR Produkten 48
2.27.1 Aufreinigung von PCR Produkten 48
2.27.2 DNA Sequenzierung 48
3 EXPERIMENTE UND ERGEBNISSE 50
3.1 Stand der Forschung 50
3.2 MnSOD Aufreinigung aus humaner Leber 51
3.2.1 Darstellung nach Gelelektrophorese 52
3.2.2 Identifizierung durch Aminosäure Teilsequenzierung 53
3.2.3 Nachweis von anti MnSOD Antikörpem bei Patienten mit IM 54
3.3 Präparation polyklonaler anti MnSOD Antikörper 55
3.3.1 Titerbestimmung und Spezifitätskontrolle der anti MnSOD Antikörper 55
3.3.2 Präparation von anti MnSOD Antikörpem der Ig Klasse G 57
3.4 Untersuchungen zu Isoformen der MnSOD 58
3.4.1 Nachweis von MnSOD Isoformen nach isoelektrischer Fokussierung 58
3.4.2 Nachweis von MnSOD Isoformen nach Auftrennung durch PAGE 61
3.4.3 Aminosäure Teilsequenzierung von MnSOD Isoformen nach 2D Gelelektrophorese 63
3.4.4 Auftreten von MnSOD Isoformen in Patienten Seren 65
3.4.5 Autoantikörper gegen MnSOD Isoformen bei Patienten mit akuter Virusinfektion 67
3.4.6 Aufreinigung von MnSOD aus Patientenseren 69
3.5 Charakterisierung von Kryoproteinen im Immunblot 71
3.5.1 Nachweis von anti MnSOD Kryoglobulinen 73
3.6 Hemmung der MnSOD Aktivität durch spezifische Antikörper in vitro 74
3.7 Auftreten von anti MnSOD und anti TIM Antikörpern im Verlauf der EBV Infektion
(Immunblot) 75
3.8 MnSOD Gehalt in Seren von Patienten mit akuten Virus Infektionen 77
3.8.1 MnSOD ELISA als diagnostischer Test bei der Untersuchung von Blutspendern 78
3.8.2 MnSOD Konzentration bei akuten Virusinfektionen 79
3.8.2.1 EBV Infektion 79
Seite IV Inhaltsverzeichnis
3.8.2.2 Andere Virusinfektionen 81
3.8.3 MnSOD im Verlauf von Virusinfektionen 83
3.9 Auftreten von anti MnSOD Antikörpern bei Virusinfektionen 84
3.10 Vergleich der Konzentrationen von MnSOD und anti MnSOD Antikörpern bei akuten
Virusinfektionen 85
3.11 Kasuistiken von akuten EBV Infektionen 86
3.12 EBV Infektion in vitro und die Rolle der MnSOD 91
3.12.1 MnSOD in superinfizierten B Lymphozyten 93
3.12.2 EBV Infektion von B Lymphozyten in vitro 95
3.13 Untersuchungen zum Auftreten von MnSOD mRNA 96
3.13.1 Isolierung von B Lymphozyten aus mononukleären Zellen 96
3.13.2 Isolierung von Gesamt RNA aus verschiedenen Zellen und Geweben 91
3.13.3 Nachweis von MnSOD RNA durch RT PCR 98
3.13.3.1 Identifizierung des PCR Produkts durch DNA Sequenzierung 100
3.13.4 Isolierung von mRNA und Nachweis von MnSOD mRNA durch RT PCR 102
3.13.5 Expression von MnSOD mRNA in B Lymphozyten und B Lymphomzellen 103
4 DISKUSSION 105
4.1 Die MnSOD und ihre Isoformen 105
4.2 Die Gene der MnSOD 108
4.3 Die Expression der MnSOD und ihre Regulation 110
4.4 Nachweis der MnSOD kodierenden mRNA 113
4.5 Zelluläre Freisetzung von MnSOD 115
4.6 Die humane MnSOD als Ziel von Autoantikörpern 117
4.7 Autoantikörper im Verlauf der EBV Infektion 120
4.8 Anti MnSOD Antikörper und ihre pathogene Potenz 128
4.9 Bildung von Superoxid Radikalen 131
4.10 Die Rolle der MnSOD bei der EBV Infektion Ein Oberblick 133
4.11 Ausblick 134
5 ZUSAMMENFASSUNG 136
6 LITERATUR 138
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