Untersuchungen zur Rolle reduktiver Initialreaktionen im aeroben mikrobiellen Metabolismus von 2,4,6-Trinitrotoluol (TNT):
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INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
I
1.1
PERSPEKTIVEN
DER
MIKROBIOLOGIE
IN
DER
UMWELTDISKUSSION
1
1.2
DER
FREMDSTOFFCHARAKTER
VON
TNT
2
1.3
DAS
VON
TNT
AUSGEHENDE
GEFAHRENPOTENTIAL
4
1.4
INITIALE
ANGRIFFSMECHANISMEM
IM
METABOLISMUS
VON
NITROAROMATEN
5
1.5
ABBAU
VON
TNT
IM
BODEN
12
1.6
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
13
2
MATERIAL
UND
METHODEN
15
2.1
ORGANISMEN
15
2.2
KULTIVIERUNG
DER
ORGANISMEN
15
2.2.1
NAEHRLOESUNGEN
15
2.2.2
ANREICHERUNGEN
16
2.2.3
STAMMHALTUNG
UND
REINHEITSKONTROLLE
17
2.2.4
ANZUCHT
DER
BAKTERIENSTAEMME
17
2.2.5
ERNTE
DER
ZELLEN
UND
HERSTELLUNG
VON
ZELLSUSPENSIONEN
18
2.3
TAXONOMISCHE
METHODEN
18
2.3.1
KOH-TEST
18
2.3.2
GRAM-FAERBUNG
18
2.3.3
API-TEST-SYSTEM
19
2.3.4
BIOLOG-TEST-SYSTEM
19
2.3.5
SUBSTRATVERWERTUNGSSPEKTRUM
19
2.4
BESTIMMUNG
DER
BIOMASSE
20
2.4.1
TRUEBUNGSMESSUNG
20
2.4.2
TROCKENGEWICHTSBESTIMMUNG
20
2.4.3
PROTEINBESTIMMUNG
GANZER
ZELLEN
20
2.5
SUBSTRATUMSATZ
MIT
RUHENDEN
ZELLEN
20
2.6
MESSUNG
VON
ENZYMAKTIVITAETEN
21
2.6.1
HERSTELLUNG
ZELLFREIER
EXTRAKTE
21
2.6.2
MESSUNG
EINER
TNT
REDUZIERENDEN
ENZYMAKTIVITAET
21
2.6.3
MESSUNG
EINER
H
'
-TNT
UMSETZENDEN
ENZYMAKTIVITAET
22
2.7
EMS-MUTAGENESE
22
2.7.1
MUTATIONSAUSLOESUNG
22
2.7.2
MUTANTENANREICHERUNG
22
2.7.3
SELEKTION
DER
MUTANTEN
23
2.8
VERSUCHE
MIT
RADIOAKTIV
MARKIERTEM
TNT
24
2.8.1
VERSUCHSAUFBAU
24
2.8.2
PROBENAHME
25
2.8.3
MESSUNG
DER
RADIOAKTIVITAET
26
2.9
BESTIMMUNG
DES
NEMST'SCHEN
VERTEILUNGSKOEFFIZIENTEN
VON
TNT
FUER
DAS
ZWEIPHASENSYSTEM
HEPTAMETHYLNONAN/WASSER
26
2.10
ANALYTISCHE
METHODEN
27
2.10.1
KOLORIMETRISCHE
METHODEN
27
2.10.1.1
PROTEINBESTIMMUNG
ZELLFREIER
EXTRAKTE
27
2.10.1.2
NACHWEIS
VON
NITRIT
27
2.10.1.3
NACHWEIS
VON
AMMONIUM
28
2.10.2
HOCHDRUCKFLUESSIGKEITSCHROMATOGRAPHIE
(HPLC)
29
2.10.3
LONENCHROMATOGRAPHIE
33
2.10.3.1
ANIONENCHROMATOGRAPHIE
ZUR
BESTIMMUNG
VON
NITRIT
33
2.10.3.2
KATIONENCHROMATOGRAPHIE
ZUR
BESTIMMUNG
VON
AMMONIUM
33
2.11
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
VON
SUBSTANZEN
33
2.11.1
EXTRAKTION
33
2.11.2
PRAEPARATIVE
HOCHDRUCKFLUESSIGKEITSCHROMATOGRAPHIE
34
2.11.3
LONENPAAREXTRAKTION
35
2.11.4
EINENGEN
VON
EXTRAKTEN
UNTER
ARGON-SCHUTZGASATMOSPHAERE
35
2.11.5
GEFRIERTROCKNUNG
35
2.11.6
ULTRAFILTRATION
ZUR
ABTRENNUNG
VON
PROTEINEN
36
2.11.7
PRAEPARATIVE
DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE
36
2.11.8
KATIONENAUSTAUSCH-CHROMATOGRAPHIE
36
2.12.3.1
HPLC/MS
37
2.12
SPEKTROSKOPISCHE
METHODEN
37
2.12.1
UV/VIS-SPEKTROSKOPIE
37
2.12.2
KEMRESONANZ-SPEKTROSKOPIE
37
2.12.3
MASSENSPEKTROMETRIE
(MS)
37
2.12.3.2
ELEKTROSPRAY-MASSENSPEKTROMETRIE(ES-MS)
38
2.13
SYNTHESE
VON
CHEMIKALIEN
38
2.13.1
UMSETZUNG
VON
TNT
MIT
NATRIUMBORHYDRID
38
2.13.2
DARSTELLUNG
DES
H
'
-TNT
KOMPLEXES
39
2.13.3
SYNTHESE
VON
HYDROXYLAMINODINITROTOLUOL
39
2.14
CHEMIKALIEN
40
3
EXPERIMENTE
UND
ERGEBNISSE
41
3.1
ANREICHERUNGEN
41
3.1.1
BESTIMMUNG
DES
VERTEILUNGSKOEFFIZIENTEN
VON
TNT
41
3.1.2
ANREICHERUNG
UND
ISOLIERUNG
TNT
VERWERTENDER
BAKTERIEN
42
3.2
CHARAKTERISIERUNG
DER
ISOLIERTEN
BAKTERIENSTAEMME
44
3.2.1
MORPHOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
44
3.2.2
PHYSIOLOGISCHE
EIGENSCHAFTEN
45
3.2.3
VERWERTUNG
VERSCHIEDENER
NITROAROMATEN
ALS
STICKSTOFFQUELLE
47
3.2.4.1
VERWERTUNG
VON
NITROAROMATEN
BEI
KULTIVIERUNG
AUF
AGARPLATTEN
47
3.2.4.2
VERWERTUNG
VON
DINITRO
UND
NITROTOLUOLEN
ALS
STICKSTOFFQUELLE
IN
FLUESSIGKULTUR
49
3.3
WACHSTUM
DER
BAKTERIENSTAEMME
TNT-8
UND
TNT-32
MIT
TNT
49
3.3.1
WACHSTUM
AUF
AGARPLATTEN
49
3.3.2
WACHSTUM
IN
FLUESSIGKULTUR
50
3.3.2.1
EINFLUSS
DES
PH-WERTES
52
3.3.2.2
EINFLUSS
DER
TNT-KONZENTRATION
AUF
DAS
WACHSTUM
54
3.3.2.3
STIMULATION
DES
WACHSTUMS
BEI
ZUGABE
VON
HEFEEXTRAKT
56
3.3.2.4
WACHSTUM
MIT
TNT
ALS
ALLEINIGER
KOHLENSTOFF-,
ENERGIE
UND
STICKSTOFFQUELLE
59
3.4
DARSTELLUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DES
HYDRID-MEISENHEIMER-KOMPLEXES
VON
TNT
(H--TNT)
60
3.4.1
MASSENSPEKTROMETRIE
60
3.4.1.1
HPLC/MS
60
3.4.1.2
ELEKTROSPRAY-MASSENSPEKTROMETRIE
63
3.4.2
NMR-SPEKTROSKOPIE
63
3.4.3
UV/VIS-ABSORPTIONSSPEKTRUM
64
3.4.4
STABILITAET
VON
H'-TNT
IN
LOESUNGEN
65
3.5
UMSATZVERSUCHE
MIT
RUHEZELLEN
DER
STAEMME
TNT-8
UND
TNT-32
68
3.5.1
OPTIMIERUNG
DER
UMSATZ
UND
ANZUCHTBEDINGUNGEN
68
3.5.2
UMSATZ
VON
TNT
DURCH
RUHEZELLEN
72
3.5.2.1
IDENTIFIZIERUNG
VON
REDUKTIONSPRODUKTEN
72
3.5.2.2
BILANZIERUNG
DES
UMSATZES
75
3.5.3
UMSATZ
VON
H'-TNT
DURCH
RUHEZELLEN
78
3.5.4
RUHEZELLUMSATZ
VON
DINITRO
UND
NITROTOLUOLEN
81
3.5.5
RUHEZELLUMSATZ
VON
HYDROXYLAMINODINITROTOLUOL
81
3.5.6
CHARAKTERISIERUNG
DES
PRODUKTS
RTL,3
85
3.6
EMS-MUTAGENESE
86
3.7
WACHSTUM
VON
PSEUDOMONAS
SP.
KLON
A
(2NT
'
)
MIT
TNT
UND
DINITROTOLUOL
89
3.8
UMSATZVERSUCHE
MIT
RUHEZELLEN
VON
PSEUDOMONAS
SP.
KLON
A
(2NT')
93
3.8.1
UMSATZ
VON
TNT
93
3.8.2
UMSATZ
VON
H'-TNT
94
3.8.3
UMSATZ
VON
24DNT
UND
26DNT
96
3.8.4
UMSATZ
VON
HYDROXYLAMINODINITROTOLUOL
98
3.9
VERSUCHE
MIT
DEN
STAEMMEN
MYCOBACTERIUM
SP.
HL
4-NT-L
UND
RHODOCOCCUS
ERYTHROPOLIS
HL
PM-1
100
3.9.1
UMSATZ
VON
TNT
DURCH
ZELLSUSPENSIONEN
100
3.9.1.1
IDENTIFIZIERUNG
DER
INITIALEN
METABOLITE
100
3.9.1.2
BILANZIERUNG
DES
UMSATZES
102
3.9.2
UMSATZ
VON
H'-TNT
DURCH
ZELLSUSPENSIONEN
108
3.9.3
VERSUCHE
ZUM
WACHSTUM
MIT
TNT
114
3.9.4
ISOLIERUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DES
GELBEN
PRODUKTS
RT3
116
3.9.4.1
MASSENSPEKTROMETRIE
DES
GELBEN
PRODUKTS
NACH
REINIGUNG
MITTELS
PRAEPARATIVER
HPLC
119
3.9.4.2
LONENPAAREXTRAKTION
UND
AUFARBEITUNG
UNTER
ARGON
120
3.9.4.3
GEFRIERTROCKNUNG
121
3.9.4.4
ELEKTROSPRAY-MASSENSPEKTROMETRIE
121
3.9.4.5
NMR-SPEKTROSKOPIE
123
3.9.5
UMSATZ
VON
24DNT
UND
26DNT
DURCH
ZELLSUSPENSIONEN
127
3.9.6
UMSATZ
VON
HYDROXYLAMINODINITROTOLUOL
128
3.10
VERSUCHE
MIT
RADIOAKTIV
MARKIERTEM
TNT
131
3.10.1
UMSATZ
VON
[
14
C]TNT
DURCH
RUHEZELLEN
VON
MYCOBACTERIUM
SP.
HL
4-NT-L
UND
RHODOCOCCUS
ERYTHROPOLIS
HL
PM-1
131
3.10.2
WACHSTUM
DER
STAEMME
TNT-8
UND
TNT-32
MIT
[
14
C]TNT
134
3.11
UMSATZVERSUCHE
IM
ZELLFREIEN
EXTRAKT
136
3.11.1
UMSATZ
VON
TNT
IM
ZELLFREIEN
EXTRAKT
136
3.11.2
UMSATZ
VON
H*-TNT
DURCH
ROHEXTRAKT
137
4
DISKUSSION
141
4.1
CHARAKTERISIERUNG
DES
TNT-METABOLISMUS
DURCH
TNT
VERWERTENDE
BAKTERIEN
142
4.1.1
ANREICHERUNG
VON
BAKTERIEN
MIT
TNT
ALS
ALLEINIGER
STICKSTOFFQUELLE
142
4.1.2
DIE
BEDEUTUNG
DES
H
'
-TNT-KOMPLEXES
FUER
DEN
METABOLISMUS
DER
TNT
VERWERTENDEN
BAKTERIEN
146
4.1.3
TRANSFORMATION
VON
TNT
DURCH
NITROARYLREDUKTASEN
UND
FOLGEREAKTIONEN
147
4.1.4
HYDROXYLAMINODINITROTOLUOL
ALS
KRITISCHES
INTERMEDIAT
BEIM
WACHSTUM
MIT
TNT
152
4.2
COMETABOLISMUS
VON
TNT
DURCH
TNT
NICHT
VERWERTENDE
BAKTERIENSTAEMME
157
4.2.1
TRANSFORMATION
VON
TNT
DURCH
NITROARYLREDUKTASEN
157
4.2.2
BILDUNG
UND
WEITERE
METABOLISIERUNG
DES
H
'
-TNT-KOMPLEXES
161
4.3
FAZIT:
ABSCHLIESSENDE
VERGLEICHE
ZWISCHEN
TNT
VERWERTENDEN
UND
TNT
COMETABOLISIERENDEN
BAKTERIENSTAEMMEN
172
5
ZUSAMMENFASSUNG
179
6
LITERATURVERZEICHNIS
180
7
ANHANG
194 |
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