Desensitivierung der cholinerg induzierten Insulinsekretion an isolierten Langerhansschen Inseln der Ratte: Rolle der Proteinkinase C und der G-Protein gekoppelten Rezeptorkinasen
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 PROTEINKINASE C 1
1.1.1 EINFUEHRUNG 1
1.1.2 STRUKTUR DER ISOENZYME DER PROTEINKINASE C 1
1.1.3 BIOCHEMISCHE EIGENSCHAFTEN DER ISOENZYME:
AKTIVIERUNG, INAKTIVIERUNG UND SUBSTRATSPEZIFITAET 4
1.1.4 AKTIVITAETSBESTIMMUNG DER PROTEINKINASE C 7
1.1.5 GEWEBE- UND INTRAZELLULAERE VERTEILUNG DER ISOENZYME 8
1.1.6 ISOENZYME IN INSULIN-SEZEMIERENDEN ZELLEN 9
1.2 INHIBITOREN UND AKTIVATOREN DER PROTEINKINASE C 10
1.2.1 ALLGEMEINES 10
1.2.2 PHORBOLESTER 13
1.2.3 STAUROSPORIN 15
1.2.4 BISINDOLYLMALEINIMIDE 17
1.2.5 PROTEINKINASE C-PEPTID (19-31) 18
1.2.6 AUSWAHLKRITERIEN 20
1.3 INSULINSEKRETION 21
1.3.1 ANATOMIE DER LANGERHANSSCHEN INSEL 21
1.3.2 MEDIATOREN DER INSULINSEKRETION 21
1.3.3 GLUCOSE-INDUZIERTE INSULINSEKRETION 25
1.3.4 EINFLUSS VON CARBACHOL AUF DIE INSULINSEKRETION 26
1.4 DESENSITIVIERUNG 27
1.4.1 EINFUEHRUNG 27
1.4.2 AUFBAU DER MUSKARINREZEPTOREN 28
1.4.3 G-PROTEIN GEKOPPELTE REZEPTORKINASEN (GRK):
AUFBAU, VORKOMMEN, AKTIVIERUNG, SUBSTRATE UND HEMMUNG 30
1.4.4 DESENSITIVIERUNG G-PROTEIN GEKOPPELTER REZEPTOREN 32
1.4.4.1 EINFUEHRUNG 32
1.4.4.2 VERAENDERUNGEN DER REZEPTORFUENKTION 33
1.4.4.3 ROLLE DER REZEPTORSPEZIFISCHEN KINASEN BEI DER DESENSITIVIERUNG
(GRK) 34
1.4.4.4 ROLLE DER EFFEKTORKINASEN BEI DER DESENSITIVIERUNG (PKC) 34
1.4.4.5 WEITERE MECHANISMEN 36
1.4.5 DESENSITIVIERUNG DER INSULINSEKRETION 38
1.5 FRAGESTELLUNG DER ARBEIT
40
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/948094109
INHALTSVERZEICHNIS
II
2 MATERIAL 41
2.1 VERSUCHSTIERE 41
2.2 GERAETE 41
2.3 VERBRAUCHSMATERIALIEN 42
2.4 CHEMIKALIEN, REAGENZIEN 43
2.5 LOSUNGEN 44
2.5.1 LOESUNGEN FUER INSULINSEKRETIONSVERSUCHE 44
2.5.1.1 KREBS-RINGER-HEPES-PUFFER (KRH) 44
2.5.1.2 RPMI 1640-MEDIUM 45
2.5.1.3 ELEKTROPORATIONSPUFFER 46
2.5.2 LOESUNGEN FIIR DEN INSULIN-RADIOIMMUNOASSAY (RIA) 46
2.5.2.1 WASCHPUFIFER 46
2.5.2.2 ISOTOPENPUFFER 47
2.5.3 STAMMLOESUNGEN 47
3 METHODEN 50
3.1 ISOLIERUNG LANGERHANSSCHER INSELN AUS DEM PANKREAS DER RATTE 50
3.2 PERMEABILISIERUNG VON LANGERHANSSCHEN INSELN 51
3.2.1 EINLEITUNG 51
3.2.2 METHODEN ZUR PERMEABILISIERUNG 52
3.2.2.1 DETERGENTIEN ODER STREPTOLYSIN O 52
3.2.2.2 ELEKTROPORATION 52
3.2.3 BERECHNUNG DER FREIEN CALCIUMKONZENTRATION 54
3.2.4 ELEKTROPORATIONSBEDINGUNGEN 55
3.2.5 KONTROLLE DER ELEKTROPORATIONSBEDINGUNGEN 55
3.2.5.1 AUSMASS DER ELEKTROPORATION (PROPIDIUMJODID) 55
3.2.5.2 CHARAKTERISIERUNG DER PORENGROESSE (FITC-DEXTRAN) 57
33 VERSUCHE ZUR INSULINSEKRETION 58
3.3.1 VORINKUBATION 58
3.3.1.1 ALLGEMEINE BEDINGUNGEN 58
3.3.1.2 SPEZIELLE VORINKUBATIONSBEDINGUNGEN BEI VERSCHIEDENEN
INHIBITOREN 5 9
3.3.2 INSULINSEKRETION IM STATISCHEN SYSTEM (HAUPTINKUBATION) 60
INHALTSVERZEICHNIS
IN
3.3.3 INSULINSEKRETION IM DYNAMISCHEN SYSTEM (PERIFUSION) 61
3.3.3.1 AUFBAU DER PERIFUSIONSAPPARATUR 61
3.3.3.2 VALIDIERUNG DES SYSTEMS 64
3 3.3.3 DURCHFUEHRUNG DER PERIFUSION 67
3.4 BESTIMMUNG DES INS
ULINS 67
3.4.1 TESTPRINZIP 67
3.4.2 DURCHFUEHRUNG 68
3.4.3 EMPFINDLICHKEIT UND GENAUIGKEIT DER METHODE 68
3.4.4 BERECHNUNG DER ERGEBNISSE 69
3.5 STATISTIK 69
4 ERGEBNISSE 70
4.1 EINFUEHRUNG 70
4.2 DESENSITIVIERUNG DER CARBACHOL-INDUZIERTEN INSULINSEKRETION 70
4.3 BETEILIGUNG DER PROTEINKINASE C AN DER DESENSITIVIERUNG 73
4.3.1
EINFUEHRUNG 73
4.3.2 BEEINFLUSSUNG DER DESENSITIVIERUNG DURCH DEN PHORBOLESTER TPA 73
4.3.3 BEEINFLUSSUNG DER DESENSITIVIERUNG DURCH STAUROSPORIN 79
4.3.4 BEEINFLUSSUNG DER DESENSITIVIERUNG DURCH RO 31-8220 81
4.3.5 BEEINFLUSSUNG DER DESENSITIVIERUNG DURCH PKC-PEPTID (19-31) 81
4.4 BETEILIGUNG DER G-PROTEIN GEKOPPELTEN REZEPTORKINASEN (GRK)
AN DER DESENSITIVIERUNG 87
5 DISKUSSION 90
5.1 INSULINSEKRETION NACH CARBACHOL-GABE 90
5.2 DESENSITIVIERUNG DER CARBACHOL-INDUZIERTEN INSULINSEKRETION 91
5.3 MOEGLICHKEITEN DER AKTIVIERUNG UND INHIBIERUNG DER PROTEINKI|IASE C
92
5.3.1 KONTROLLE DER INHIBIERUNG DER PROTEINKINASE C 92
5.3.2 AKTIVIERUNG UND INHIBIERUNG DER PROTEINKINASE C DURCH DIE
EINGESETZTEN SUBSTANZEN , 93
5.3.2.1 TPA 93
5.3.2.2 STAUROSPORIN 95
5.3.2.3 RO 31-8220 95
5.3.24 PKC-PEPTID (19-31) 96
INHALTSVERZEICHNIS
IV
5.3.2.5 PKC-ANTIKOERPER 97
5.3.3 ZUSAMMENFASSUNG DER MOEGLICHKEITEN DER AKTIVIERUNG UND
INHIBIERUNG DER PROTEINKINASE C 97
5.4 ROLLE DER PROTEINKINASE C BEI DER DESENSITIVIERUNG DURCH CARBACHOL
98
5.4.1 ARGUMENTE FUER EINE BETEILIGUNG DER PROTEINKINASE C BEI DER
DESENSITIVIERUNG DURCH CARBACHOL 98
5.4.1.1 AKTIVIERUNG DER PROTEINKINASE C DURCH TPA 98
5.4.1.2 INAKTIVIERUNG DER PROTEINKINASE C DURCH TPA 99
5.4.2 ARGUMENTE GEGEN EINE BETEILIGUNG DER PROTEINKINASE C BEI DER
DESENSITIVIERUNG DURCH CARBACHOL 100
5.4.2.1 STAUROSPORIN 100
5.4.2.2 RO 31-8220 100
5.4.23 PKC-PEPTID (19-31) 101
5.4.3 ZUSAMMENFASSENDE BEWERTUNG DER ROLLE DER PROTEINKINASE C BEI DER
DESENSITIVIERUNG 101
5.5 ROLLE DER G-PROTEIN GEKOPPELTEN REZEPTORKINASEN (GRK) UND WEITERER
MECHANISMEN BEI DER DESENSITIVIERUNG DURCH CARBACHOL 104
5.6 ROLLE DER PROTEINKINASE C BEI DER DESENSITIVIERUNG DURCH GLUCOSE 105
5.7 SCHLUDBETRACHTUNG 107
6 ZUSAMMENFASSUNG 110
6.1 FRAGESTELLUNG 110
6.2 ERGEBNISSE 111
6.3 SCHLUSSFOLGERUNGEN 112
7 LITERATURVERZEICHNIS
113 |
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