Isolierung und Charakterisierung des nifV-Genes und des strukturverwandten leuA-Genes aus Anabaena spec. Stamm PCC 7120:
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INHALTSVERZEICHNIS _ I
INHALTSVERZEICHNIS . I
ABKUERZUNGEN. V
I. EINLEITUNG . 1
1.1 TAXONOMIE DER CYANOBAKTERIEN. 2
1.2 ZELLDIFFERENZIERUNG BEI CYANOBAKTERIEN . 2
1.3 DIFFERENZIERUNG DER HETEROZYSTEN . 5
1.4 BIOLOGISCHE STICKSTOFF-FIXIERUNG . 6
1.5 AMINOSAEURE METABOLISMUS . 11
1.5.1 LEUCIN BIOSYNTHESE . 11
1.5.2 LYSIN BIOSYNTHESE . 13
II. MATERIAL UND METHODEN. 15
1. MATERIAL
. 15
1.1 BAKTERIENSTAEMME . 15
1.2 PLASMIDE . 16
1.3 VERWENDETE SONDEN . 16
1.4 GERAETE . 17
1.5 AUFLISTUNG VON GENEN ALS GRUNDLAGE EINER KODON-BENUTZUNGSTABELLE FUER
ANABAENA
7120 . 18
1.6 VERWENDETE SOFTWARE . 19
1.7 VERBRAUCHSMATERIAL . 19
1.8 CHEMIKALIEN UND RADIONUKLIDE. 19
1.9 KITS UND ENZYME . 20
1.10 OLIGONUKLEOTIDE . 20
1.11 NAEHRMEDIEN UND PUFFER . 21
2.
METHODEN. 23
2.1 ANZUCHT . 23
2.1.1
ANABAENA 7120 . 23
2.1.2
ESCHERICHIA COLI . 23
2.1.3
RHODOBACTER CAPSULATUS. 24
2.2 TRANSFORMATION VON
E. COLI DURCH HITZESCHOCK . 24
2.3 TRANSFORMATION VON
E. COLI DURCH ELEKTROPORATION . 25
2.4 PRAEPARATION VON NUKLEINSAEUREN . 26
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/948073179
INHALTSVERZEICHNIS
II
2.4.1 PLASMID PRAEPARATION AUS
E. COLI . 26
2.4.2 PRAEPARATION GENOMISCHER DNA AUS
ANABAENA! 120 . 27
2.4.3 PRAEPARATION UNGESCHERTER DNA AUS
ANABAENA 7120 ZUR PFGE. 27
2.4.4 PRAEPARATION VON RNA AUS
ANABAENA 7120 . 28
2.4.5 PHOTOMETRISCHE KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN . 29
2.5 MODIFIKATION VON DNA . 30
2.5.1 RESTRIKTION . 30
2.5.2 LIGATION . 30
2.5.3 AUFFULLEN UEBERHAENGENDER 5'-ENDEN MIT KLENOW-ENZYM. 30
2.5.4 GERICHTETE DELETION DURCH EXONUKLEASE UEI/SL-NUKLEASE BEHANDLUNG .
31
2.5.5 MARKIERUNG VON DNA-SONDEN ZUR HYBRIDISIERUNG . 31
2.5.5.1 NICHTRADIOAKTIVE DIG-DNA MARKIERUNG. 32
2.5.5.2RANDOM-PRIMED DNA-MARKIERUNG MIT AP
2P]ATP . 32
2.5.6 SPEZIFISCHE AMPLIFIKATION VON DNA DURCH PCR . 32
2.6 GELELEKTROPHORESEN . 34
2.6.1 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE ZUR AUFTRENNUNG VON GROSSEN
DNA-FRAGMENTEN . 34
2.6.1.1 ELUTION VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN . 34
2.6.2 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE ZUR AUFTRENNUNG VON RNA . 34
2.6.3 PULS FELD GELELEKTROPHORESE (PFGE). 35
2.6.4 ACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE ZUR AUFTRENNUNG KLEINER DNA FRAGMENTE.
35
2.7 SPEZIFISCHER NACHWEIS VON NUKLEINSAEUREN . 37
2.7.1 SOUTHERN BLOTTING . 37
2.7.1.1 VACUUMBLOT . 37
2.7.1.2 KAPILLARBLOT . 37
2.7.3 KOLONIEABZUG . 38
2.7.4 HYBRIDISIERUNG UND DETEKTION VON NUKLEINSAEUREN . 39
2.7.4.1 NICHTRADIOAKTIVE DNA/DNA-HYBRIDISIERUNG . 39
2.7.4.2 RADIOAKTIVE DNA/RNA-HYBRIDISIERUNG . 40
2.8 DNA-SEQUENZIERUNG . 40
2.9 HETEROLOGE KOMPLEMENTATION . 41
2.9.1 HERSTELLUNG EINES PLASMIDES ZUR KOMPLEMENTATIONSANALYSE DER
RHODOBACTER CAPSULATUS NIFV
MUTANTEN R2291/II . 41
2.9.2 TRANSFER VON MOBILISIERBAREN PLASMIDEN AUS ESCHERICHIA COLI S17-1
NACH
RHODOBACTER CAPSULATUS . 43
2.10 BESTIMMUNG DER NITROGENASE ENZYMAKTIVITAET . 43
2.10.1 GASCHROMATOGRAFISCHE BESTIMMUNG VON ETHYLEN UND ETHAN. 43
2.11 COMPUTERANALYSEN UND DATENBANKRECHERCHEN . 44
INHALTSVERZEICHNIS
YY YYYY
UI
III. ERGEBNISSE .
46
3.1 ISOLIERUNG DES
NIFV GENS UND DES LEUA GENS .
47
3.2 SEQUENZ DES
NIFV GENS UND DES LEUA GENS SOWIE BENACHBARTER LESERAHMEN
VONANABAENAL\2Q
.
48
3.3 ANALYSE DER ABGELEITETEN AMINOSAEURESEQUENZEN DES
NIFV UND DES LEUA GENS
VON
ANABAENA 7120.
57
3.4 ISOLIERUNG VON COSMIDEN MIT FLANKIERENDEN BEREICHEN VON
NIFV UND LEUA
AUS
ANABAENA 7120 . 63
3.5 KARTIERUNG DES
NIFV UND DES LEUA GENS IM GENOM VON ANABAENA 7120 . 67
3.6 UNTERSUCHUNG DER ABHAENGIGKEIT DER TRANSKRIPTION DES
NIFV GENS UND DES
LEUA
GENS VON ANABAENA 7120 VON DER STICKSTOFFQUELLE IM MEDIUM . 70
3.7 FUNKTIONSANALYSE VON
NIFV UND LEUA AUS ANABAENA 7120 DURCH KOMPLEMENTATION
VON
NIFV~ MUTANTEN VON RHODOBACTER CAPSULATUS. 72
IV. DISKUSSION . 76
4.1 ISOLIERUNG DES
NIFV GENS AUS ANABAENA 7120 MIT HILFE DER
POLYMERASE KETTENREAKTION . 76
4.2 IDENTIFIKATION DES NIFV UND DES STRUKTURVERWANDTEN LEUA AUS
ANABAENA 7120 DURCH
SEQUENZVERGLEICH .
78
4.3 DAS
NIFV GEN AUS ANABAENA 7120. 80
4.3.1 DAS
NIFV GEN VON ANABAENA 7120 LIEGT ETWA 50 KB STROMABWAERTS DER
NITROGENASE STRUKTURGENE . 80
4.3.2 DER DNA-BEREICH STROMAUFWAERTS DES
NIFV GENS VON ANABAENA 7120 . 81
4.3.3 DAS
NIFV GEN AUS ANABAENA 7120 WIRD IN ABHAENGIGKEIT VON DER STICKSTOFFQUELLE
EXPRIMIERT. 81
4.3.4 DAS
NIFV GEN VON ANABAENA 7120 KOMPLEMENTIERT NIFV~ MUTANTEN
VON
RHODOBACTER CAPSULATUS . 83
4.4 DIE BEDEUTUNG DES
LEUA GENS BEI DER LEUCIN BIOSYNTHESE IN ANABAENA 7120 . 84
4.4.1 DAS
LEUA GEN VON ANABAENA 7120 KARTIERT RAEUMLICH GETRENNT VOM LEUB GEN .
84
4.4.2 TRANSKRIPTION DES
LEUA GENS VON ANABAENA 7120 UND DER BENACHBARTEN
LESERAHMEN IN ABHAENGIGKEIT VON DER STICKSTOFFQUELLE .
86
4.5 AUSBLICK . 89
INHALTSVERZEICHNIS
IV
V. ZUSAMMENFASSUNG . 90
VI. LITERATUR. 91
VII. ANHANG . 106
DANKSAGUNG.109 |
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