Etablierung eines transgenen Mausmodells zur Funktionsaufklärung der Urokinase-Urokinaserezeptor-Interaktion bei der Metastasierung von Tumorzellen:
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1995
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
DAS
UROKINASE/UROKINASEREZEPTOR
SYSTEM
DER
PLASMINOGENAKTIVIERUNG
.
2
1.1.1
DIE
UROKINASE
.
3
1.1.2
DIE
INHIBITOREN
.
3
1.1.3
DER
UROKINASEREZEPTOR
.
4
1.1.4
PLASMIN
.
5
1.2
DER
UROKINASE-WEG
DER
PLASMINOGENAKTIVIERUNG
UND
KREBS
.
7
1.3
TRANSGENE
TIERMODELLE
FUER
DIE
TUMORFORSCHUNG
.
9
1.3.1
TRANSGENE
TIERE
.
9
1.3.2
TRANSGENE
TIERMODELLE
IN
DER
ONKOLOGIE
.
11
1.4
DAS
MAUS-MAMMA-TUMOR-VIRUS
(MMTV)
.
12
1.4.1
DIE
REGULATION
DES
MMTV
.
12
1.4.2
DAS
MMTV-VIRUS
UND
KREBS
.
14
1.4.3
TRANSGENE
TIERMODELLE
DER
BRUSTDRUESEN-TUMORENTWICKLUNG
UND
METASTASIERUNG
UNTER
VERWENDUNG
DES
MMTV-PROMOTORS
.
14
1.5
DER
WAP-PROMOTOR/ENHANCER:
SEINE
REGULATION
UND
VERWENDUNG
FUER
TRANSGENE
BRUSTDRUESENTUMOR-MODELLE
.
15
1.6
ZIELSETZUNGEN
DER
ARBEIT
.
16
2
MATERIAL
UND
METHODEN
.
18
2.1
MATERIAL
.
18
2.1.1
ENZYME
UND
CHEMIKALIEN
.
18
2.1.2
STANDARDPUFFER
.
18
2.1.3
OLIGONUKLEOTIDE
.
19
2.1.4
PLASMIDE
.
20
2.1.5
VERWENDETER
E.
COLI-STAMM
.
20
2.1.6
VERWENDETE
SAEUGERZELLINIEN
.
20
2.1.7
ERSTELLUNG
DER
TRANSGENEN
MAEUSE
.
21
2.1.7.1
VERWENDETE
MAEUSESTAEMME
.
21
2.1.7.2
MIKROINJEKTION
VON
DNS
IN
MAEUSEZYGOTEN
.
21
2.1.7.3
PRAEPARATION
VON
ORGANEN
.
21
2.2
METHODEN
.
22
2.2.1
MIKROBIOLOGISCHE
TECHNIKEN
.
22
2.2.1.1
MEDIEN
UND
ANZUCHTBEDINGUNGEN
FUER
E.
COLI
.
22
2.2.1.2
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
E.COLI
ZELLEN
.
22
2.2.1.3
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
.
22
2.2.2
TECHNIKEN
IN
DER
ZELLKULTUR
.
23
2.2.2.1
MEDIEN
UND
KULTIVIERUNGSBEDINGUNGEN
.
23
2.2.2.2
TRANSFEKTION
DURCH
LIPOFEKTION
.
23
2.2.3
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
24
2.2.3.1
ISOLIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
24
2.2.3.1.1
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNS
.
24
2.2.3.1.2
SCHNELLPRAEPARATION
VON
PLASMID-DNS
.
25
2.2.3.1.3
GROSSPRAEPARATION
VON
PLASMID-DNS
.
25
2.2.3.1.4
ISOLIERUNG
CHROMOSOMALER
DNS
.
25
2.2.3.1.4.1
DNS
AUS
DER
SCHWANZSPITZE
EINER
MAUS
.
25
2.2.3.1.4.2
DNS
AUS
ANDEREN
GEWEBEN
.
26
2.2.3.1.4.3
DNS
AUS
ZELLEN
.
26
2.2.3.1.5
ISOLIERUNG
VON
DNS
AUS
AGAROSEGELEN
.
26
2.2.3.2
QUANTITATIVE
BESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
26
2.2.3.3
METHODEN
ZUR
ANALYTIK
UND
NEUKOMBINATION
VON
DNS
.
27
2.2.3.3.1
SPALTUNG
VON
DNS
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
27
2.2.3.3.2
HERSTELLUNG
GLATTER
ENDEN
AN
RESTRIKTIONSFRAGMENTEN
.
27
2.2.33.3
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNS-FRAGMENTEN
.
27
2.2.3.3.4
LIGATION
VON
DNS-FRAGMENTEN
.
28
2.2.3.3.5
AMPLIFIKATION
VON
DNS-FRAGMENTEN
DURCH
DIE
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION28
2.2.33.6
MARKIERUNG
VON
DNS-FRAGMENTEN
MIT
DIGOXIGENIN
IN
DER
PCR
.
29
2.2.33.7
HYBRIDISIERUNG
VON
DNS-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN:
SOUTHERN
BLOT
.
29
2.23.4
METHODEN
ZUR
RNS-ANALYSE
.
30
2.23.4.1
REVERSE
TRANSKRIPTION
MIT
ANSCHLIESSENDER
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
.
30
2.23.4.2
HYBRIDISIERUNG
VON
RNS
AUF
SLOT
BLOT-FILTEM
.
31
2.2.4
METHODEN
ZUR
PROTEINANALYSE
.
32
2.2.4.1
PROBENVORBEREITUNG
FUER
DIE
UROKINASEREZEPTOR-ANALYSE
.
32
2.2.4.2
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
32
2.2.43
WESTERN
BLOT
.
33
2.2.4.4
MARKIERUNG
DES
AMINOTERMINALEN
FRAGMENTES
(ATF)
DER
UROKINASE
MIT
125
1
.
33
2.2.4.5
DETEKTION
DES
UROKINASEREZEPTORS:
12S
I-ATF
CROSSLINKING
.
34
2.2.4.6
QUANTIFIZIERUNG
DES
UROKINASEREZEPTORS
DURCH
ELISA
.
34
2.2.4.7
DURCHFLUSSCYTOMETRISCHE
ANALYSE
DES
UROKINASEREZEPTORS
(FACS-ANALYSE)
.
34
2.2.4.8
PROBENVORBEREITUNG
FUER
DIE
UROKINASE-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
.
35
2.2.4.9
QUANTIFIZIERUNG
DER
HUMANEN
UROKINASE
MITTELS
ELISA
.
35
2.2.4.10
AKTIVITAETSTEST
FUER
HUMANE
UROKINASE
.
36
3
ERGEBNISSE
.
37
3.1
VEKTORDESIGN
DER
EXPRESSIONSPLASMIDE
FUER
DIE
ETABLIERUNG
TRANSGENER
MAEUSE
.
37
3.1.1
DER
EXPRESSIONSVEKTOR
FUER
HUMANE
UROKINASE
.
37
3.1.2
DER
EXPRESSIONSVEKTOR
FUER
DEN
HUMANEN
UROKINASEREZEPTOR
.
39
3.2
UEBERPRUEFUNG
DER
EXPRESSIONSVEKTOREN
IN
ZELLKULTUR
DURCH
ETABLIERUNG
STABILER
TRANSFEKTANTEN
.
40
3.2.1
DER
UROKINASE-VEKTOR:
EXPRESSION
UND
PROTEINFUENKTION
.
40
3.2.2
DAS
UROKINASEREZEPTOR-PLASMID:
EXPRESSION
UND
FUNKTION
DES
PROTEINS
.
42
3.3
ERSTELLUNG
TRANSGENER
MAEUSE
FUER
HUMANE
UROKINASE
UND
DEN
HUMANEN
UROKINASEREZEPTOR:
UNTERSUCHUNGEN
AUF
DNS-EBENE
.
48
3.3.1
UROKINASE-TRANSGENE
MAEUSE
.
49
3.3.2
UROKINASEREZEPTOR-TRANSGENE
MAEUSE
.
52
3.4
EXPRESSIONSANALYSE
DER
TRANSGENEN
MAEUSE
.
56
3.4.1
UROKINASE-TRANSGENE
MAEUSE:
RNS-EXPRESSION
.
56
3.4.2
UROKINASE-TRANSGENE
MAEUSE:
PROTEINEXPRESSION
.
58
3.4.3
UROKINASEREZEPTOR-EXPRESSION
IN
DER
BRUSTDRUESE:
RNS-ANALYSE
.
61
3.4.4
UROKINASEREZEPTOR-TRANSGENE
MAEUSE:
PROTEINEXPRESSION
.
63
3.5
DER
METHYLIERUNGSSTATUS
DES
TRANSGENEN
MMTV-PROMOTORS
.
67
3.5.1
UROKINASEREZEPTOR-TRANSGENE
MAEUSE
.
67
3.5.2
UROKINASE-TRANSGENE
MAEUSE
.
71
3.6
ERSTELLUNG
EINER
ZWEITEN
SERIE
UROKINASEREZEPTOR-TRANSGENER
MAEUSE
ZUR
AUFKLAERUNG
DES
ZUSAMMENHANGS
PROMOTOR-METHYLIERUNG
UND
GENEXPRESSION:
ANALYSE
AUF
DNS-EBENE.74
3.6.1
ANALYSE
DER
UPAR-EXPRESSION
UNTER
BERUECKSICHTIGUNG
DES
MMTV-PROMOTORS:
METHYLIERUNGSSTATUS,
STABILITAET
IN
DER
VERERBUNG
UND
AUSWIRKUNGEN
AUF
DIE
PROTEINEXPRESSION
.
75
3.6.1.1
DIE
EXPRESSIONS-NEGATIVEN
UPAR-II
LINIEN
-2
UND
-6
.
78
3.6.1.2
UNTERSUCHUNG
DER
UPAR-II-TRANSGENEN
LINIE-4
.
80
3.6.1.3
UNTERSUCHUNG
DER
UPAR-II
LINIE
1
.
83
4
DISKUSSION
.
99
4.1
DER
AUFBAU
DER
EXPRESSIONSVEKTOREN
.
100
4.2
TRANSGENE
MAEUSE
FUER
DIE
UROKINASE
SOWIE
DEN
UROKINASEREZEPTOR
UND
IHRE
EXPRESSIONSEIGENSCHAFTEN
.
102
4.3
DNS-METHYLIERUNG
UND
GENREGULATION
.
104
4.3.1
DNS-METHYLIERUNG
UND
REGULATION
DER
GENEXPRESSION
BEI
TRANSGENEN
.
106
4.4
DIE
UROKINASE
UND
UROKINASEREZEPTOR-TRANSGENEN
MAEUSE:
REGULATION
DER
EXPRESSION
DURCH
METHYLIERUNG?
.
107
4.5
DIE
ZWEITE
SERIE
UPAR-TRANSGENER
MAEUSE:
KLAERUNG
DES
ZUSAMMENHANGS:
PROMOTORMETHYLIERUNG
UND
GENEXPRESSION
.
109
4.6
AUSBLICK
.
115
5
ZUSAMMENFASSUNG
.
117
6
LITERATURVERZEICHNIS
.
119
7
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
133
8
DANKSAGUNG
.
135 |
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