Die Genstruktur von CD44: Versuche zur Elimination der Funktion diskreter Isoformen
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Karlsruhe
Forschungszentrum Karlsruhe
1995
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Einleitung 1
Struktur von CD44 Proteinen und ihre Wechselwirkungen mit anderen
Molekülen 1
CD44 Expression während der Embryonalentwicklung der Maus 3
Expression und Funktion von CD44 im immunologischen System 4
Die Expression von CD44 Isoformen befähigt Tumorzellen zur
Metastasierung 6
Gezielte Mutation des CD44 Gens durch homologe Rekombination in
embryonalen Stammzellen (gene targeting) 7
Zielsetzung der Arbeit 9
Material und Methoden 10
1 .Bezugsquellen 10
2.Plasmide 11
3.Genbanken 11
4.Bakterienstämme 12
5.Zellinien 12
ö.Hybridisierungsproben 12
7. Oligonukleotide 12
8.Transformation von Bakterien 13
8.1 .Herstellung kompetenter Bakterien 13
8.2.Transformation von Bakterien mit Plasmid DNA 13
9.Infektion von Bakterien mit Bakteriophagen 14
9.1 .Herstellung von kompetenten Bakterien plating cells 14
9.2.Infektion von Bakterien mit Lambda Phagen 14
lO.Präparation von Nukleinsäuren 14
10.1. small scale Präparation von Plasmid DNA 14
10.2. large scale Präparation von Plasmid DNA 15
10.3.Präparation von Phagen DNA 15
10.4.Präparation von DNA aus Säugerzellen 15
10.5.Präparation von RNA aus Säugerzellen 16
10.6.Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 16
1 l.Enzymatische Behandlung von Nukleinsäuren 16
11.1. Restriktionsendonukleasen 16
11.2.Alkalische Phosphatase 17
11.3.T4 DNA Polymerase 17
11.4.T4DNALigase 17
12.Elektrophorese von Nukleinsäuren 17
12.1. Analytische Agarosegelelektrophorese 17
12.2.Präparative Agarosegelelektrophorese 18
12.3.Analytische Polyacrylamidgelelektrophorese 18
13.Radioaktive Markierung von Nukleinsäuren 19
13.1 .Markierung von DNA Fragmenten 19
13.2.Markierung von Oligonukleotiden 19
14.Analyse von Nukleinsäuren 19
14.1.Southern Blot Analyse 19
14.2.Sequenzierung 20
14.3.Amplifikation von DNA Sequenzen durch PCR 21
15.Klonierung von Nukleinsäuren 21
15.1.Klonierung von cDNA verschiedener CD44 Isoformen 21
15.2.Klonierung von genomischen Sequenzen der variablen Region 22
15.3.Klonierung der Amplifikationsprodukte der genomischen
Sequenzen 23
15.4.Klonierung der Targeting Konstrukte 23
lö.Kultur von embryonalen Stammzellen 24
16.1.Isolierung und Inaktivierung embryonaler Fibroblasten 24
16.2.Konditionierung von ES Zellkulturmedium 25
16.3.Subklonierung von ES Zellen 26
16.4.Analyse des Karyotyps 26
16.5.Elektroporation von ES Zellen und Klonierung 26
16.6.Injektion der ES Zellen in Blastozysten 27
16.7.GPI Analyse 28
Ergebnisse 29
Die Heterogenität der variablen Region entsteht durch differentielles
Spleißen von 10 Exons 29
Gezielte Mutation der variablen Region des CD44 Gens der Maus durch
homologe Rekombination in ES Zellen 44
Deletion der Exons v6 und v7 in ES Zellen 44
Injektion der heterozygoten ES Zellen in Blastozysten 54
Deletion des integrierten Selektionsmarker durch homologe
Rekombination 56
Diskussion 62
Literaturverzeichnis 69
Lebenslauf 75
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