Über die Wirkung zweier Sphingomyelinanaloga auf die Proliferation und Phosphatidylcholin-Biosynthese in der immortalisierten humanen Keratinozytenzellinie HaCaT:
Gespeichert in:
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|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
1996
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INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
5
1
EINLEITUNG
7
1.1
PHOSPHATIDYLCHOLIN
UND
SEINE
SYNTHESE
7
1.2
PHOSPHOLIPIDE
UND
SIGNALTRANSDUKTION
10
1.3
REGULATION
DER
ZELLPROLIFERATION
12
1.4
SPHINGOMYELINE
UND
DEREN
STOFFWECHSELWEGE
15
1.5
DER
SPHINGOMYELINZYKLUS
17
1.6
CERAMID
ALS
MOEGLICHER
SECOND
MESSENGER
ANTIPROLIFERATIVER
STOFFWECHSELWEGE
19
1.7
BEEINFLUSSUNG
VON
ENZYMEN
DURCH
CERAMID
21
1.8
SPEZIFITAET
DER
CERAMID-WIRKUNG
21
1.9
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
23
2
MATERIAL
UND
METHODEN
25
2.1
MATERIAL
25
2.1.1
ZELLINIEN
25
2.1.2
ZELLKULTUR
25
2.1.3
REAGENZIEN
25
2.1.4
GERAETE
27
2.2
METHODEN
28
2.2.1
METHODEN
ZUR
EXPRESSION
VON
CTP:PHOSPHOCHOLIN-CYTIDYLYLTRANSFERASE
IN
INSEKTENZELLEN
28
2.2.1.1
KULTUR
VON
SF-9
INSEKTENZELLEN
29
2.2.1.2
NACHWEIS
DER
CTP:PHOSPHOCHOLIN-CYTIDYLYLTRANSFERASE
UND
BESTIMMUNG
DES
OPTIMALEN
EXPRESSIONSZEITPUNKTES
29
2.2.1.3
PRODUKTION
VON
ZELLPELLETS
FUER
DIE
REINIGUNG
30
2.2.1.4
PRODUKTION
EINES
HOCHTITER-VIRUSSTOCKS
30
2.2.1.4.1
PRODUKTION
IN
ZELLKULTURSCHALEN
30
2.2.1.4.2
PRODUKTION
IN
SPINNERKULTUR
31
2.2.1.5
PLAQUE-ASSAY
31
2.2.1.6
MASSENPRODUKTION
VON
CTP:PHOSPHOCHOLIN-CYTIDYLYLTRANSFERASE
34
2.2.2
METHODEN
ZUR
REINIGUNG
DER
CTP:PHOSPHOCHOLIN-CYTIDYIYLTRANSFERASE
34
2.2.2.1
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
34
2.2.2.2
HYDROXYLAPATIT-CHROMATOGRAPHIE
38
2.2.2.2.1
ZYTOSOLEXTRAKTION
38
2.2.2.2.2
SAEUREFAELLUNG
UND
DETERGENZEXTRAKTION
39
2
2.2.2.1.3
HYDROXYLAPATIT-CHROMATOGRAPHIE
39
2.2.3
KONZENTRATION
DER
PROTEINFRAKTIONEN
40
2.2.4
METHODEN
ZUR
WIRKUNG
DER
SPHINGOMYELINANALOGA
AUF
DIE
PROLIFERATION
UND
PC-BIOSYNTHESE
IN
HACAT-ZELLEN
41
2.2.4.1
ARBEITEN
MIT
MENSCHLICHEN
KERADNOZYTEN
41
2.2.4.2
ZYTOTOXIZITAETSTEST
42
2.2.4.3
PROLIFERATIONSMESSUNG
43
2.2.4.4
CHOLIN-EINBAU
44
2.2.4.4.1
RADIOISOTOPENMARKIERUNG
44
2.2.4.4.2
EXTRAKTION,
TRENNUNG
UND
QUANTIFIZIERUNG
DER
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
LIPIDE
UND
CHOLINMETABOLITEN
45
2.2.4.4.3
AUFBEREITUNG
DER
ZELLPELLETS
FUER
EINE
PROTEINBESTIMMUNG
46
2.2.4.5
DIGITONIN-RELEASE
46
2.2.4.6
CTP:
PHOSPHOCHOLIN-CYTIDYLYLTRANSFERASE-BESTIMMUNG
48
2.2.4.6.1
HERSTELLEN
VON
LIPOSOMEN
48
2.2.4.6.2
ENZYMTEST
48
2.2.4.6.3
EXTRAKTION,
TRENNUNG
UND
QUANTIFIZIERUNG
DES
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
CDP-CHOLINS
49
2.2.4.7
AUFNAHME
DER
SPHINGOMYELINANALOGA
IN
HACAT-ZELLEN
50
2.2.5
VORBEREITUNG
DER
REINIGUNGSFRAKTIONEN
FUER
DIE
SDS-PAGE
51
2.2.6
PROBENVORBEREITUNG
FUER
DIE
ZELLPELLETANALYSE
51
2.2.7
SDS-PAGE
51
2.2.7.1
ANFAERBEN
DER
AUFGETRENNTEN
PROTEINE
53
2.2.8.
WESTEMBLOT
54
2.2.8.1
IMMUNDETEKTION
54
2.2.8.2
LUMINOLMETHODE
55
2.2.9
PROTEINBESTIMMUNG
MIT
DEM
BCA-TEST
56
2.2.10
ELISA
56
2.2.11
STATISTISCHE
METHODEN
57
3
ERGEBNISSE
58
3.1
EXPRESSION
DER
CTP:PHOSPHOCHOLIN-CYTIDYLYLTRANSFERASE
IN
INSEKTENZELLEN
58
3.1.1
NACHWEIS
DER
EXPRESSION
UND
BESTIMMUNG
DES
OPTIMALEN
EXPRESSIONSZEITPUNKTES
58
3.1.2
PRODUKTION
VON
HOCHTITER-VIRUSSTOCK
58
3.1.3
BESTIMMUNG
DES
VIRUSTITERS
VON
P3S
UND
P4S
58
3
3.1.4
NACHWEIS
VON
CTP:PHOSPHOCHOLIN-CYTIDYLYLTTANSFERASE
AUS
P3S
UND
P4S
59
3.2
REINIGUNG
DER
CTP:PHOSPHOCHOLIN-CYTIDYLYLTRANSFERASE
61
3.2.1
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
61
3.2.2
HYDROXYLAPADT-CHROMATOGRAPHIE
66
3.2.2.1
ANALYSE
DES
AUS
INSEKTENZELLEN
GEWONNENEN
CTP:PHOSPHOCHOLIN
CYTIDYLYLTRANSFERASE-EXTRAKTES
66
3.2.2.2
ANALYSE
DER
ELUTIONSFRAKTIONEN
66
3.3
WIRKUNG
DER
SPHINGOMYELINANALOGA
AUF
DIE
PROLIFERATION
UND
PC
BIOSYNTHESE
IN
HACAT-ZELLEN
68
3.3.1
ZYTOTOXIZITAET
DER
SPHINGOMYELINANALOGA
68
3.3.2
HEMMUNG
DER
PROLIFERATION
69
3.3.3
CHOLIN-EINBAU
IN
PHOSPHATIDYLCHOLIN
UND
SEINE
WAESSRIGEN
VORLAEUFER
71
3.3.4
AENDERUNG
DER
CYTIDYLYLTRANSFERASE-VERTEILUNG
ZWISCHEN
ZYTOSOL
UND
MEMBRANEN
UNTER
EINFLUSS
DER
SPHINGOMYELINANALOGA
73
3.3.5
HEMMUNG
DER
CTP:PHOSPHOCHOLIN-CYTIDYLYLTRANSFERASE-AKTIVITAET
IN
VITRO
75
3.3.6
UNTERSCHIEDLICHE
AUFNAHME
DER
SPHINGOMYELINANALOGA
IN
DIE
ZELLEN
77
4
DISKUSSION
78
4.1
EXPRESSION
DER
CTPTPHOSPHOCHOLIN-CYTIDYLYLTRANSFERASE
IN
INSEKTENZELLEN
78
4.2
REINIGUNG
DER
CTPRPHOSPHOCHOLIN-CYTIDYLYLTRANSFERASE
78
4.3
HEMMUNG
DER
ZELLPROLIFERATION
UND
DER
CTPRPHOSPHOCHOLIN
CYTIDYLYLTRANSFERASE-AKTIVITAET
DURCH
SPHINGOMYELINANALOGA
80
5.1
ZUSAMMENFASSUNG
87
5.2
SUMMARY
88
6
LITERATUR
90
VEROEFFENTLICHUNGEN
104
LEBENSLAUF
105
DANKSAGUNG
106 |
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