Klonierung und physikalische Kartierung der für das Alagille-Syndrom relevanten Chromosomenregion 20p11.23-p12.1 mit Hilfe von künstlichen Hefechromosomen:
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
1.1. Einführung 1
1.2. Isolierung von Krankheitsgenen 4
1.3. Klonierungssysteme 5
1.4. Das YAC (Yeast Artificial Chromosome )-Klonierungssystem 6
1.5. Segmentale Aneusomien (contiguous gene syndromes ) 7
1.6. Das Alagille Syndrom (AGS) 11
1.7. Ziel der Arbeit 14
2. Material Methoden 15
2.1. Material 15
2.1.1. Chemikalien 15
1. Allgemeine Chemikalien 15
2. Radiochemikalien 16
3. Biochemikalien 16
4. Längenstandards 17
2.1.2. Gebrauchswaren 17
2.1.3 Geräte) 17
2.1.4. Sterilisation von Lösungen und Gefäßen 19
2.1.5. Puffer und Stammlösungen 19
2.1.6. Art und Herkunft des verwendeten Untersuchungsmaterials 20
1. Herkunft menschlicher Genom-DNA 20
2. Probanden mit Alagille Syndrom 21
2.1.7. Angaben zu verwendeten DNA-Sonden 21
2.1.8. Sequenzen und Herkunft der verwendeten Primer 23
1. Mikrodissektionsklone 23
2. Mikrosatellitenmarker, anonyme Sonde und YAC-Endfragment 24
3. Simple Sequence Repeats (SSR) 25
4. Expressed Sequence Tagged Sites (ESTs) 26
5. Primersequenzen der untersuchten Gene 26
6. Alu-Primer 27
7. Vektorspezifische Primer 27
2.1.9. Angaben zu den verwendeten YAC-Bibliotheken 28
2.1.10. Vektoren 29
2.1.11. Bakterienstämme 29
2.1.12. Antibiotika und Selektiv-Platten 29
2.2. Methoden 30
2.2.1. Isolierung von DNA aus Bakterien 30
1. Alkalische Minipräparation von Plasmid-DNA 30
2. Alkalische Maxipräparation von Plasmid-DNA 30
3. Isolierung von Cosmid-DNA 31
4. Herstellung von Stammkulturen 32
2.2.2. Gewinnung menschlicher Genom-DNA 32
1. DNA-Präparation mit Phenol-Chloroform-Extraktion 32
2. DNA-Präparation mit Protein-Aussalzung 33
3. DNA-Präparation aus Lymphoblasten 33
2.2.3. Isolierung von DNA aus YAC-Klonen 34
1. Anzucht von YAC-Klonen 34
2. Präparation von YAC-DNA in Lösung 34
3. Präparation von Hefe-DNA in Agaroseblöckchen 35
4. Kurz-Präparation von Hefe-DNA in Agaroseblöckchen 36
5. Isolierung von Hefe-DNA aus Agaroseblöckchen 37
2.2.4. Isolierung von DNA aus Gelen 37
1. Isolierung von PCR-Produkten aus Agarosegelen 37
2. Isolierung von DNA-Fragmenten aus Polyacrylamidgelen 37
3. Aufreinigung von DNA-Fragmenten durch Bindung an Glasmilch 38
2.2.5. Aufreinigung von PCR-Produkten für die Sequenzierung 38
2.2.6. Konzentrationsbestimmung von DNA 39
2.2.7. Restriktionsenzymatische Spaltung von DNA 40
2.2.8. DNA-Auftrennung durch Agarose-Gelelektrophorese 40
2.2.9. Radioaktive Markierung von DNA 41
1. Radioaktive Markierung mit dem Random-priming-System 41
2. Radioaktive Markierung mit dem Megaprime-Sy X m 42
3. Messung des Einbaus von radioaktiven Desoxyribonukleotiden 42
2.2.10. Southern S/of-Analyse 43
1. Übertragung von DNA auf Membranfilter 43
2. Vorhybridisierung und Hybridisierung 44
3. Präassoziation von Hybridisierungssonden 44
4. Filterwaschung 45
5. Densitometrische Auswertung von Autoradiogrammen 45
6. Wiederholte Verwendung von Nylonfiltem 46
2.2.11. DNA-Amplifikation über die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 46
1. Aufteinigung von synthetischen Oligonukleotiden 46
2. Ansatz der PCR 47
2.2.12. Durchmustern von YAC-Bibliotheken 49
2.2.13. Direkte PCR-Analyse von YAC-Klonen 49
2.2.14. Alu-PCR 50
2.2.15. Polyacrylamid-Gelelektrophorese(PAGE) 51
2.2.16. YAC-Endfragment-Klonierung 52
1. T-Vektor Herstellung 52
2. Phosphorylierung von DNA 53
3. Auffüllen von 5 -DNA-Überhängen 53
4. Blum end-Klonierung von DNA 53
5. Ligation von DNA 54
6. Herstellung kompetenter Bakterienzellen 54
7. Transformation in Bakterien 54
2.2.17. Sequenzierung 55
1. Dye-Primer-Fluoreszenz-Sequenzierung 55
2. Dye-Terminator-Fluoreszenz-Sequenzierung 56
3. Direkte Sequenzierung von PCR-Produkten 56
4. Anfertigung von Sequenzgelen 57
2.2.18. Computeranalyse von DNA-Sequenzen 57
2.2.19. Auftrennung hochmolekularer DNA über die Pulsfeldgelelektrophorese 58
1. Gewinnung hochmolekularer genomischer DNA in Agaroseblöckchen 58
1.1. DNA-Präparation aus Lymphocyten 59
1.2. DNA-Präparation aus Lymphoblasten 60
2. Restriktionsenzymatische Spaltung der DNA im Agaroseblöckchen 60
3. Partielle Restriktion 61
4. Herstellung eines Pulsfeldgels 61
5. Laden des Pulsfeldgels 61
6. PFGE-Laufbedingungen 62
7. PFGE-Größenmarker 62
8. Herstellung von DNA-Filtem und Hybridisierung 62
2.2.20. Computerprogramme 63
3. Ergebnisse 64
3.1. Erstellung von YAC-Contigs der AGSCR 64
3.1.1. Generation von neuen sequence tagged sites (STSs) für die
Alagille-Syndrom-Chromosomen-Region (AGSCR) 64
1. Sequenzierung der Sonde pRI2.21 (Locus D20S5) 64
2. Sequenzierung der Sonde pD3Hl 2 (Locus D20S6) 65
3. Sequenzierung der Sonde p064 (Locus D20S13) 65
4. Sequenzierung der Sonde pFMS76 (Locus D20S23) 66
3.1.2. Durchmusterung der regulären CEPH-YAC-Bibliothek 67
1. Durchmusterung mit Chromosom 20p-spezifischen DNA-Markem 67
1.1. Durchmusterung der YAC-Bibliothek mit den STSs für
D20S5, D20S6, D20S13, D20S23 und D20S27 67
1.2. Durchmusterung der YAC-Bibliothek mit Mikrodissektionsklonen 68
1.3.Durchmusterung der YAC-Bibliothek mit Mikrosatelliten-Markem 69
2. STS-con/enr-Kartierung der regulären YAC-Klone 71
3. Zusammenfassung der Ergebnisse mit regulären YAC-Klonen 73
3.1.3. Isolierung von YAC-Endfragmenten 73
1. Isolierung der Endfragmente des YACs 35OE8 74
1.1. Isolierung des URA-Endes des YACs 350E8 74
1.2. Isolierung des TRP-Endes des YACs 350E8 76
2. Sequenzierung eines YAC-Insert-Endes des YACs 16H3 78
3.1.4. Alu-Endfragment-Analyse von YAC-Klonen 79
3.1.5. Alu-fingerprint-Analyse 81
3.1.6. Durchmusterung der Mega-YAC-Bibliothek 84
1. Durchmusterung mit Chromosom 20p-spezifischen DNA-Markem 84
2. STS-confew-Kartierung der Mega-YACs 85
3.2. Charakterisierung der YACs aus der AGSCR 93
3.2.1. Größenbestimmung der YACs 93
3.2.2. Analyse der YACs mit Hilfe der Fluoreszenz in situ Hybridisierung 95
3.3. Zuordnung von Genen zu dem YAC-Contig der AGSCR 97
3.3.1. Durchmustern der YAC-Contigs mit ESTs 97
3.3.2. Bone morphogenetic protein (BMP2) 98
3.3.3. Neuroendokrine Convertase (PCSK2) 99
3.3.4. Paired box gene 1 (PAX 1) 100
3.3.5. Small nuclear ribonucleoprotein (snRNP) 100
3.3.6. Humanes Centromerprotein (CENP-B) 101
3.3.7. 7-Glutamyl-Transpeptidase (GGT) 101
3.3.8. Tyrosinphosphatase (CDC25B) 102
3.3.9. Synaptosomal assoziiertes Protein von 25 kDa (SNAP-25) 102
3.4. Molekulare Charakterisierung einer mit dem Alagille Syndrom
einhergehenden familiären Translokation 107
3.5. Restriktionskartierung von YACs der AGSCR 110
3.5.1. Physikalische Kartierung zentraler YACs der SRO für das
Alagille Syndrom mit seltenschneidenden Enzymen 110
3.5.2. Partielle Spaltungen von YAC-DNA 115
3.6. Lokalisierung von Cosmiden und anonymen DNA-Markern
in der AGSCR 121
4. Diskussion 130
4.1. Zusammenstellung von YAC-Contigs der AGSCR 130
4.2. Physikalische Kartierung der AGSCR 145
4.3. Das synaptosomal assoziierte Protein SNAP-25
als mögliches Kandidatengen der AGSCR 150
4.4. Ausblick 154
5. Zusammenfassung 156
6. Literaturverzeichnis 158
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