Synthese der L-Gulono-gamma-lacton-Oxidase in Escherichia coli: Charakterisierung und Anwendung
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1994
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5
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
.
5
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
8
1.
ZUSAMMENFASSUNG
.
10
2.
EINLEITUNG
.
11
2.1
L-ASCORBINSAEURE
(VITAMIN
C)
-
BEDEUTUNG
UND
EIGENSCHAFTEN
.
11
2.2
SYNTHESEVERFAHREN
FUER
VITAMIN
C.
.
12
2.2.1
DIE
CHEMISCHE
VITAMIN
C-SYNTHESE
.
13
2.2.2
DIE
FERMENTATIVE
VITAMIN
C-SYNTHESE.
.
14
2.2.3
DIE
VITAMIN
C-SYNTHESE
IM
ENZYMREAKTOR
.
16
2.3
BIOSYNTHESE
DER
L-ASCORBINSAEURE
IM
TIERREICH
.
18
2.4
SCHLUESSELENZYME
DER
ZWEISTUFIGEN
ENZYMATISCHEN
VITAMIN
C-SYNTHESE.
19
2.5
L-GULONO^-LACTON-OXIDASE
(GUL-OX)
UND
VERWANDTE
ENZYME
.
20
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
23
3.1
STAEMME,
PLASMIDE
UND
PHAGEN
.
23
3.2
CHEMIKALIEN,
ENZYME
UND
ANDERES
MATERIAL
.
26
3.3
MEDIEN,
PUFFER
UND
LOESUNGEN.
28
3.3.1
MEDIEN
.
28
3.3.2
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
31
3.4
STAMMHALTUNG
UND
ANZUCHTBEDINGUNGEN.
34
3.4.1
STAMMHALTUNG
.
34
3.4.2
ANZUCHTBEDINGUNGEN
.
34
3.4.2.1
INDUKTION
DES
TAC-PROMOTORS
.
35
3.4.2.2
INDUKTION
DES
T7-PROMOTORS
.
35
3.5
PROTEINANALYTISCHE
METHODEN
.
35
3.5.1
PROBENAUFBEREITUNG
.
35
3.5.2
ELEKTROPHORETISCHE
TRENNUNG
VON
PROTEINEN
.
36
6
3.5.3
DENSITOMETRISCHE
AUSWERTUNG
VON
SDS-GELEN
.
38
3.5.4
FLUOROGRAPHIE
.
38
3.5.5
QUANTIFIZIERUNG
DES
PROTEINGEHALTS
.
38
3.5.6
BESTIMMUNG
DER
ENZYMAKTIVITAETEN
.
39
3.5.6.1
SS-GALAKTOSIDASE
(SS-GAL)
.
39
3.5.6.2
L-GULONO-Y-LACTON-OXIDASE
(GUL-OX)
.
39
3.5.7
HISTOCHEMISCHE
FAERBETECHNIKEN
.
42
3.5.8
AMMONIUMSULFAT-FAELLUNG
.
43
3.6
MOLEKULARGENETISCHE
TECHNIKEN
.
43
3.6.1
DNA-PRAEPARATION
.
43
3.6.1.1
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
UEBER
CSCL-DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION.43
3.6.1.2
PLASMID-SCHNELLISOLIERUNG
("ALKALISCHE
LYSE")
.
44
3.6.1.3
PRAEPARATION
VON
EINZELSTRAENGIGER
M13-DNA
.
44
3.6.1.4
PRAEPARATION
VON
X-PHAGEN-DNA
.
45
3.6.1.5
PRAEPARATION
VON
XZAPH-DNA
.
46
3.6.2
ENZYMATISCHE
BEHANDLUNG
VON
DNA
.
48
3.6.2.1
SPALTUNG
MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
48
3.6.2.2
BEREITSTELLUNG
DES
DNA-LAENGENSTANDARDS
.
48
3.6.2.3
BEHANDLUNG
MIT
KLENOW-ENZYM
.
48
3.6.2.4
BEHANDLUNG
MIT
SL-NUKLEASE
.
48
3.6.2.5
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
ALKALISCHER
PHOSPHATASE.
.49
3.6.2.6
VERKNUEPFUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
T4
DNA-LIGASE
.
49
3.6.2.7
5
'-PHOSPHORYLIERUNG
VON
PCR-FRAGMENTEN
MIT
T4-POLYNUKLEOTIDKINASE.49
3.6.3
TRANSFER
VON
DNA
IAIE.COLI
.
49
3.6.3.1
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
.
49
3.6.3.2
TRANSFORMATION
VON
PLASMID-DNA
.
50
3.6.3.3
TRANSFEKTION
DOPPELSTRAENGIGER
(DS)
M13-DNA
.
50
3.6.4
TRANSFER
VON
DNA
IN
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
.
50
3.6.4.1
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
ZELLEN
.
50
3.6.4.2
TRANSFORMATION
VON
PLASMID-DNA
.
51
3.6.5
DNA-GELELEKTROPHORESE
.
51
3.6.5.1
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
51
3.6.5.2
DNA-ELUTION
AUS
LMP-AGAROSE
.
51
3.6.6
POLYMERASE-KETTENREAKTION
("POLYMERASE
CHAIN
REACTION",
PCR)
.
52
3.6.7
ZELLFRAKTIONIERUNG
.
52
3.6.8
IN
VITRO-TRANSLATION
.
53
3.6.8.1
IN
V/TRO-TRANSLATION
IN
RETIKULOZYTENLYSAT
.
53
3.6.8.2
IN
VIIRO-TRANSLATION
INE.COZI-S30-EXTRAKT
.
54
7
4.
ERGEBNISSE
.
55
4.1
UNTERSUCHUNGEN
DER
L-GULONO-Y-LACTON-OXIDASE
(GUL-OX)
AUF
DNA-EBENE
.
55
4.1.1
KLONIERUNG
DER
CDNA
UEBER
PCR.
.
55
4.1.2
SEQUENZERMITTLUNG
DER
GUL-OX-CDNA
.
61
4.1.3
UNTERSUCHUNG
DER
5
'-REGION
.
63
4.2
VORUNTERSUCHUNGEN
ZUR
EXPRESSION
DER
GUL-OX-CDNA
.
68
4.2.1
ANALYSE
DER
ENZYMPRODUKTION
DURCH
ZZZ
VZ'ZRO-TRANSLATION
.
68
4.2.1.1
IN
VZZRO-TRANSLATION
IN
E.COLI
.
68
4.2.1.2
IN
VZFRO-TRANSLATION
IN
RETIKULOZYTENLYSAT
.
71
4.2.2
ANALYSE
DER
ENZYMPRODUKTION
DURCH
TRANSLATIONSFUSIONEN
MITSS-GALAKTOSIDASE
74
4.3
EXPRESSION
DER
GUL-OX-CDNA
.
81
4.3.1
KONSTITUTIVE
EXPRESSION
IN
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
.
81
4.3.2
EXPRESSION
IN
E.COLI
UNTER
KONTROLLE
DES
ZAC-PROMOTORS
.
84
4.3.3
EXPRESSION
IN
E.COLI
UNTER
KONTROLLE
DES
T7-PROMOTORS
.
87
4.3.3.1
KLONIERUNG
DER
CDNA
DER
GUL-OXI
STROMABWAERTS
DES
T7-PROMOTORS.
.
87
4.3.3.2
SELEKTIVE
ENZYMPRODUKTION
IN
GEGENWART
VON
RIFAMPIZIN
.
89
4.3.3.3
ENZYMPRODUKTION
BEI
UNTERSCHIEDLICHEN
WACHSTUMSTEMPERATUREN
.
94
4.4
CHARAKTERISIERUNG
UND
ANREICHERUNG
DER
IN
E.COLI
PRODUZIERTEN
GUL-OX.
97
4.4.1
LOKALISIERUNG
DER
GUL-OX
IN
E.COLI
.
97
4.4.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
MAXIMALEN
AUSBEUTE
AN
GUL-OX
.100
4.4.2.1
MAXIMALE
AUSBEUTE
NACH
T7-EXPRESSION
.100
4.4.2.2
ANREICHERUNG
DER
GUL-OX
UEBER
AMMONHIMSULFAT-FAELLUNG
.
103
4.4.3
ART
UND
STABILITAET
DER
GUL-OX-AKTIVITAET
.104
4.5
VORUNTERSUCHUNGEN
ZUR
ZWEISTUFIGEN
VITAMIN
C-SYNTHESE
.
105
5.
DISKUSSION
.
107
5.1
SEQUENZ
DER
GUL-OX-CDNA
.
107
5.2
EXPRESSION
DER
GUL-OX-CDNA
.
109
5.3
EIGENSCHAFTEN
DER
IN
E.COLI
SYNTHETISIERTEN
GUL-OX
.
111
6.
LITERATURVERZEICHNIS
.
113
LEBENSLAUF.
.
121 |
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| topic | Vitamin C (DE-588)4063638-0 gnd Escherichia coli (DE-588)4070959-0 gnd Herstellung (DE-588)4159653-5 gnd Rekombinantes Protein (DE-588)4277353-2 gnd Gulonolactonoxidase L- (DE-588)4416835-4 gnd |
| topic_facet | Vitamin C Escherichia coli Herstellung Rekombinantes Protein Gulonolactonoxidase L- Hochschulschrift |
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