Produktion des basischen Fibroblastenwachstumsfaktors (bFGF) im Hochzelldichteverfahren mittels rekombinanter Escherichia coli:
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1.
INHALTSVERZEICHNIS
I
1.
EINLEITUNG
.
1
1.1.
EINLEITUNG
UND
LITERATURUEBERSICHT
.
.1
1.2.
PROBLEMSTELLUNG
.
.
.6
2.
THEORETISCHE
GRUNDLAGEN
.7
2.1.
BASISCHER
FIBROBLASTENWACHSTUMSFAKTOR
(BFGF)
.
7
2.2.
KULTIVIERUNG
VON
ESCHERICHIA
COLI
IM
HOCHZELLDICHTE
VERFAHREN
.
9
2.3.
INTRAZELLULARE
REAKTIONEN
AUF
STRESSSITUATIONEN
.
.11
2.3.1.
EINFLUSS
DER
TEMPERATUR
AUF
DAS
WACHSTUM
.
.11
2.3.2.
EINFLUSS
DER
TEMPERATUR
AUF
DIE
PROTEINSYNTHESE
.
11
2.3.3.
ABBAU
VON
RNA-BESTANDTEILEN
ALS
REAKTION
AUF
STRESSSITUATIONEN
.
.
.
.13
2.4.
FALTUNG
VON
REKOMBINANTEN
PROTEINEN
.
.
.
.17
2.4.1.
MOLEKULARE
MECHANISMEN
.
.
.
.17
2.4.2.
DIE
KINETIK
DER
PROTEINFALTUNG
.
.
.
.18
2.5.
DIE
AUFREINIGUNG
DER
BASISCHEN
FIBROBLASTEN
WACHSTUMSFAKTORS
.
.
.20
3.
MATERIALIEN
UND
METHODEN
.22
3.1.
PRODUKTION
VON
BFGF
.
.
.
.
.
.22
3.1.1.
MIKROORGANISMUS
UND
PLASMIDE
.
.
.22
3.1.2.
STAMMHALTUNG
.
.
.
.
.23
3.1.3.
KULTIVIERUNGSMEDIEN
.
.
.
.23
3.1.3.1.
LB-MEDIUM
.
23
3.1.3.2.
MEDIEN
FUER
DIE
HOCHZELLDICHTE
KULTIVIERUNGEN
.
.
.
.24
3.1.4.
VORKULTUREN
.
.
.
.25
3.1.5.
VERSUCHSAUFBAU
UND
VERGLEICH
DER
VERWENDETEN
REAKTORTYPEN
.25
3.1.6.
VERLAUF
EINER
HOCHZELLDICHTEKULTIVIERUNG
ZUR
PRODUKTION
VON
BFGF
.
.
.28
3.2.
ON-LINE
ANALYTIK
WAEHREND
DER
HOCHZELLDICHTEKULTIVIERUNG
.
31
3.3.
OFF-LINE
ANALYTIK
WAEHREND
DER
HOCHZELLDICHTEKULTIVIERUNG
.
33
3.3.1.
BESTIMMUNG
DES
ZELLWACHSTUMS
.
.
.33
II
1.
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.2.
BESTIMMUNG
VON
GLUCOSE-,
AMMONIUM
UND
PHOSPHATIONEN
.
.
.
.
.
.33
3.3.3.
BESTIMMUNG
DER
OSMOLALITAET
.
.
.34
3.4.
BESTIMMUNG
VON
STOFFWECHSELNEBENPRODUKTEN
DUCH
HIGH-PERFORMANCE
LIQUID
CHROMATOGRAPHY
(HPLC)
.
.35
3.5.
QUANTITATIVE
BFGF-BESTIMMUNG
.
.
.
.37
3.6.
QUALITATIVE
PROTEINANALYTIK
.
.
.38
3.6.1.
ZIELSTELLUNG,
PROBENVORBEREITUNG
UND
VERWENDETE
CHEMIKALIEN
.
.
.
.
.38
3.6.2.
GRADIENTENGELE
.
.
.
.
.39
3.6.3.
2-D
GELELEKTROPHORESE
ZUR
ISOLIERUNG
VON
BFGF
.
42
3.6.4.
UEBERTRAGUNG
VON
PROTEINEN
AUF
1-D
ODER
2-D
GELEN
MITTELS
BLOTTING
AUF
MEMBRANEN
ZWECKS
ANTIKOERPER
SPEZIFISCHER
FAERBUNG
.
.
.
.44
3.6.5.
ANTIKOERPERFAERBUNG
.
.
.
.
.44
3.7.
AUFARBEITUNGSSTRATEGIE
FUER
BFGF
.
.
.
.45
3.7.1.
ZELLERNTE
.
.
.
.
.
.45
3.7.2.
ZELLAUFSCHLUSS.
.
.
.
.
.
.45
3.7.3.
ABTRENNUNG
DER
UNLOESLICHEN
PROTEINFRAKTION
VON
DEN
LOESLICHEN
PROTEINEN
.
.
.
.
.46
3.7.4.
LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE
.
.
.46
3.7.5.
DIALYSE
.
.
.
.
.47
3.7.6.
HEPARIN-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
.
.48
3.7.7.
AUFNAHME
DER
ADSORPTIONSISOTHERMEN
VON
BFGF
AN
CM-SEPHAROSE
UND
HEPARIN
.
.
.48
3.8.
MESSUNG
DES
CIRCULARDICHROISMUS
(CD-SPEKTREN)
.
.
49
3.9.
SEQUENZANALYSE
.
.
.
.
.
.50
3.10.
BIOLOGISCHER
AKTIVITAETSTEST
FUER
BFGF
.
.
.51
4.
ERGEBNISSE
UND
DISKUSSION
.52
4.1.
UNTERSUCHUNGEN
DER
VERWENDETEN
PLASMIDE
HINSICHTLICH
IHRES
EXPRESSIONSVERHALTENS
.
.
.52
4.1.1.
SCHUETTELKOLBENVERSUCHE
.
.
.
.52
4.1.2.
VERGLEICH
DER
EXPRESSIONSSYSTEME
IN
HOCHZELLDICHTEKULTIVIERUNGEN
.
.
.54
1.
INHALTSVERZEICHNIS
III
4.2.
DIE
PRODUKTION
VON
BFGF
MITTELS
THERMISCHER
INDUKTION
.
61
4.2.1.
DER
EINFLUSS
DES
INDUKTIONSZEITPUNKTES
.
.61
4.2.2.
KINETISCHE
BETRACHTUNGEN
.
.
.68
4.2.2.1.
DIE
DARSTELLUNG
DER
EXPRESSIONSRATE
.
.
68
4.2.2.2.
DIE
DARSTELLUNG
DER
IN
VIVO
FALTUNG
UND
STABILITAET
VON
BFGF
.
.
.73
4.3.
DIE
PRODUKTION
VON
BFGF
IM
50
1
MASSSTAB
.
.80
4.4.
STOFFWECHSELUNTERSUCHUNGEN
AN
.
COLI
WAEHREND
HOCHZELLDICHTEKULTIVIERUNGEN
.
.
.84
4.4.1.
DIE
ANREICHERUNG
VON
STOFFWECHSELNEBENPRODUKTEN
IM
MEDIUM
.
.
.
.84
4.4.2.
DIE
ANREICHERUNG
VON
URACIL
IM
MEDIUM.
.
88
4.4.3.
DER
EINFLUSS
DER
OSMOLALITAET
DES
MEDIUMS
.
.
93
4.5.
ERGEBNISSE
UND
DISKUSSION
DER
CHROMATOGRAPHISCHEN
AUFREINIGUNGSSCHRITTE
.
.
.95
4.6.
PRODUKTCHARAKTERISIERUNG
.
.
.
.
.106
4.6.1.
2-D
GELELEKTROPHORESE
.
.
.
.106
4.6.2.
MESSUNG
DES
CIRCULARDICHROISMUS
(CD)
VON
BFGF
.109
4.6.3.
SEQUENZANALYSE
DES
REKOMBINANTEN
PROTEINS
BFGF
.112
4.6.4.
BIOLOGISCHER
AKTIVITAETSTEST
FUER
BFGF
.
.114
5.
ZUSAMMENFASSUNG
.117
6.
SYMBOLVERZEICHNIS.
.
.120
6.1.
ABKUERZUNGEN
.
.120
6.2.
FORMELZEICHEN
.
.
.121
7.
LITERATURVERZEICHNIS
.123
8.
ANHANG
.
.133
8.1.
HOCHZELLDICHTEKULTIVIERUNGEN
.
.
.
.
.133
8.2.
BATCH
VERSUCHE
ZUR
BINDUNG
VON
BFGF
AN
CM-SEPHAROSE
UND
HEPARIN
.
.
.
.
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