Das Insulin-like Growth Factor System der menschlichen Kolonkarzinomzellinie Caco-2:
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1
1.1.
INSULIN-IIKE
GROWTH
FACTORS
I
UND
-II
(IGF-I
UND
-II)
1
1.1.1.
EXPRESSION
VON
IGF-1I
3
1.1.2.
EXPRESSION
VON
IGF-I
5
1.2.
REZEPTOREN
FUER
IGF-I
UND
IGF-II
5
1.2.1.
INSULIN
REZEPTOR
FAMILIE
6
1.2.1.1.
IGF-I
REZEPTOR:
GENSTRUKTUR
UND
LIGANDENBINDUNG
6
1.2.1.2.
SIGNALUEBERTRAGUNG
VON
TYROSINKINASE
REZEPTOREN
7
1.2.2.
IGF-LI/MANNOSE
6-PHOSPHAT
REZEPTOR
8
1.2.2.1.
GENSTRUKTUR
UND
-EXPRESSION
DES
IGF-II/M6P
REZEPTORS
9
1.2.2.2.
STRUKTUR
UND
FUNKTION
DES
IGF-II/M6P
REZEPTORS
10
1.2.2.3.
SIGNALUEBERTRAGUNG
DURCH
DEN
1GF-II/M6P
REZEPTOR
11
1.3.
IGF-BINDUNGSPROTEINE
12
1.4.
KOLONKARZINOTNZELLEN
ALS
DIFFERENZIERUNGSMODELLE
15
1.5.
ZIELSETZUNG
16
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
17
2.1.
ARBEITEN
AN
ZELLMONOLAYERN
17
2.1.1.
ZELLKULTUR
17
2.1.1.1.
ANZUCHT
DER
ZELLEN
17
2.1.1.2.
SUBKULTIVIERUNG
(TRYPSINIERUNG)
18
2.1.1.3.
RUECKFRIEREN
DER
ZELLEN
18
2.1.1.4.
STUDIENDESIGN
DER
DIFFERENZIERUNGSSTUDIE
18
2.1.1.5.
HERSTELLUNG
DER
KONDITIONIERTEN
MEDIEN
18
2.1.1.6.
HERSTELLUNG
DER
PROTEINLYSATE
18
2.1.2.
KOMPETITIVE
RADIOREZEPTOR-BINDUNGSSTUDIE
18
2.I.2.I.
SCATCHARD-ANALYSE
19
2.1.3.
BIOASSAY
20
2.2.
PROTEIN-BIOCHEMISCHE
METHODEN
21
2.2.1.
PROTEINBESTIMMUNG
21
2.2.2.
PROTEINBESTIMMUNG
IN
KONDITIONIERTEN
MEDIEN
21
2.2.3.
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
22
2.2.4.
ELEKTROTRANSFER
VON
PROTEINEN
AUF
NITROZELLULOSE
23
2.2.5.
LIGANDEN-BLOT-ANALYSE
23
2.2.6.
AFFINITAETSVEMETZUNG
24
2.2.7.
ENZYMBESTIMMUNGEN
25
2.2.7.1.
ALKALISCHE
PHOSPHATASE
25
2.2.7.2.
CREATIN
KINASE
25
2.2.7.3.
LAKTAT
DEHYDROGENASE
26
2.3.
RNA-UNTERSUCHUNGEN
26
2.3.1.
RNA-EXTRAKTION
26
2.3.2.
PHOTOMETRISCHE
MENGENBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
27
2.3.3
RNA-GELELEKTROPHORESE
27
2.3.4.
RNA-TRANSFER
AUF
NYLONMEMBRANEN
28
2.3.5.
METHYLENBLAU-FAERBUNG
29
2.3.6.
NORTHEM-BLOT-HYBRIDISIERUNG
MIT
RADIOAKTIV
MARKIERTEN
CDNA-SONDEN
29
2.3.6.1.
VERWENDETE
CDNA-FRAGMENTE
29
2.3.6.2.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
DER
CDNA
-
RANDOM
PRIMING
29
2.3.6.3.
HYBRIDISIERUNG
30
2.3.7.
SOLUTION
HYBRIDIZATION/RNASE
PROTECTION
ASSAY
31
2.3.7.1.
VERWENDETE
CDNA-SEQUENZEN
33
2.3.7.2.
AUFARBEITUNG
DER
CDNA-MATRIZE
33
2.3.7.3.
HERSTELLUNG
RADIOAKTIV
MARKIERTER
RNA-SONDEN
34
2.3.7.4.
MOLEKULARGEWICHTSSTANDARD
35
2.3.7.5.
VORBEREITUNG
DER
ZELLULAEREN
RNA
35
2.3.7.6.
HYBRIDISIERUNG
VON
ZELLULAERER
RNA
MIT
RIBOPROBEN
36
23.7.7.
PROBENAUFARBEITUNG
36
2.3.7.8.
GELELEKTROPHORESE
37
23.7.9.
DENSITOMETRISCHE
ANALYSE
38
2.4.
OPTISCHE
METHODEN
39
2.4.1.
RASTERELEKTRONENMIKROSKOPIE
39
2.4.2.
MIKROPHOTOGRAPHIE
39
2.5.
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
40
2.5.1.
WESTEM-BLOT-ANALYSE
40
2.5.2.
RADIOIMMUNOASSAYS
41
2.5.2.1.
IOF-II
RIA
41
2.5.2.2.
IGFBP-2
RIA
42
2.5.2.3.
IGFBP-3
RIA
43
2.5.2.4.
IGF-I
RIA
43
2.5.3.
CARCINOEMBRYONALES
ANTIGEN
43
2.6.
SONSTIGE
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
44
2.6.1.
DNA-EXTRAKTION
44
2.6.2.
TRANSFORMATION
44
2.6.3.
PLASMIDISOLIERUNG
45
2.6.3.1.
POLYETHYLENGLYCOL-PRAEPARATION
45
2.6.3.2.
CHROMATOGRAFISCHE
PRAEPARATION
46
2.6.4.
RESTRIKTIONSVERDAU
47
2.6.5.
SUBKLONIERUNG
47
3.
ERGEBNISSE
50
3.1.
DAS
IGF-SYSTEM
VON
CACO-2
ZELLEN
50
3.1.1.
KOMPETITIVE
RADIOREZEPTOR-BINDUNGSSTUDIE
MIT
1GF-I
50
3.1.1.1.
AFFINITAETSVEMETZUNG
VON
L25
J-IGF-I
51
3.1.2.
KOMPETITIVE
RADIOREZEPTOR-BINDUNGSSTUDIE
MIT
IGF-II
52
3.1.2.1.
AFFINITAETSVEMETZUNG
VON
I25
J-IGF-I1
53
3.1.2.2.
IGF-II/M6P
REZEPTOR-NACHWEIS
MITTELS
WESTEM-BLOT-ANALYSE
54
3.1.3.
SEKRETION
VON
KOMPONENTEN
DES
IGF-SYSTEMS
IN
KONDITIONIERTES
MEDIUM
55
3.13.1.
1GF-I
55
3.13.2.
IGF-II
55
3.13.3.
SEKRETIONSPROFIL
DER
IGF-BINDUNGSPROTEINE
55
3.13.4.
IDENTIFIZIERUNG
VON
IGFBP-2
UND
-3
MITTELS
WESTEM-BLOT-ANALYSE
56
3.1.4.
RNA-EXPRESSION
VON
KOMPONENTEN
DES
IGF-SYSTEMS
58
3.1.4.1.
IGF-I
REZEPTOR
RNA
58
3.1.4.2.
IGF-LI/MANNOSE
6-PHOSPHAT
REZEPTOR
RNA
59
3.1.43.
IGF-II
RNA
60
3.1.4.4.
1GF-1
RNA
61
3.14.5.
IGFBP
RNA
61
3.2.
WACHSTUM
UND
DIFFERENZIERUNG
VON
CACO-2
ZELLEN
61
3.2.1.
MORPHOLOGISCHE
ASPEKTE
DER
DIFFERENZIERUNG
VON
CACO-2
ZELLEN
62
3.2.2.
BIOCHEMISCHE
ASPEKTE
VON
WACHSTUM
UND
DIFFERENZIERUNG
64
3.2.2.1.
DNA-,
RNA
UND
PROTEINGEHALT
WAEHREND
DER
ZELLDIFFERENZIERUNG
64
3.2.2.2.
ALKALISCHE
PHOSPHATASE
AKTIVITAET
UND
PROTEINGEHALT
IM
ZELLYSAT
67
3.2.23.
CREATIN
KINASE
AKTIVITAET
IM
ZELLYSAT
68
3.2.2.4.
LAKTAT
DEHYDROGENASE
AKTIVITAET
IM
KONDITIONIERTEN
MEDIUM
68
3.2.2.5.
CARCINOEMBRYONALES
ANTIGEN
UND
PROTEINGEHALT
IM
KONDITIONIERTEN
MEDIUM
69
3.3.
RNASE
PROTECTION:
CHARAKTERISIERUNG
DES
MESSSYSTEMS
70
3.3.1.
INTEGRITAET
DER
UNTERSUCHTEN
RNA-PROBEN
70
3.3.2.
DENSITOMETRIE
71
3.3.3.
RNASE
PROTECTION:
PRAEZISIONSMESSUNG
UND
VALIDIERUNG
DER
METHODE
72
3.3.4.
EXEMPLARISCHE
DARSTELLUNG
EINES
VERSUCHSERGEBNISSES
73
3.4.
EINZELKOMPONENTEN
WAEHREND
DER
DIFFERENZIERUNG
74
3.4.1.
GLYCERINALDEHYDPHOSPHAT
DEHYDROGENASE
RNA-EXPRESSION
74
3.4.2.
SS-AKTIN
RNA-EXPRESSION
75
3.4.3.
IGF-I
RNA-EXPRESSION
WAEHREND
DER
DIFFERENZIERUNG
76
3.4.4.
IGF-II
RNA-EXPRESSION
WAEHREND
DER
DIFFERENZIERUNG
76
3.4.5.
IGF-II
IMMUNREAKTIVITAET
IM
KONDITIONIERTEN
MEDIUM
77
3.4.6.
IGF-REZEPTOR
RNA-EXPRESSION
WAEHREND
DER
DIFFERENZIERUNG
77
3.5.
IGF-BINDUNGSPROTEINE
WAEHREND
DER
DIFFERENZIERUNG
78
3.5.1.
SEKRETION
DER
IGF-BINDUNGSPROTEINE
IN
KONDITIONIERTES
MEDIUM
79
3.5.2.
IGFBP
RNA-EXPRESSION
WAEHREND
DER
DIFFERENZIERUNG
80
3.6.
KORRELATIONSANALYSEN
81
3.6.1.
KOMPONENTEN
DES
IGF-SYSTEMS
82
3.6.2.
PROLIFERATIONSMARKER
83
3.6.3.
DI
FFERENZIERUNGSMARKER
84
3.7.
BIOLOGISCHE
WIRKUNGEN
DES
IGF-SYSTEMS
IN
CACO-2
ZELLEN
85
4.
DISKUSSION
87
4.1.
DAS
IGF-SYSTEM
VON
CACO-2
ZELLEN
87
4.1.1.
IGF-I
REZEPTOR
87
4.1.2.
IGF-II/M6P
REZEPTOR
88
4.1.3.
IGF-II
89
4.1.4.
IGF-BINDUNGSPROTEINE
89
4.2.
DAS
IGF-SYSTEM
IM
ZUSAMMENHANG
MIT
WACHSTUM
UND
DIFFERENZIERUNG
90
4.2.1.
IGF-I
REZEPTOR
RNA-EXPRESSION
WAEHREND
DER
DIFFERENZIERUNG
91
4.2.2.
IGF-I1/M6P
REZEPTOR
RNA-EXPRESSION
WAEHREND
DER
DIFFERENZIERUNG
91
4.2.3.
IGF-11
EXPRESSION
WAEHREND
DER
DIFFERENZIERUNG
92
4.2.4.
IGF-I
EXPRESSION
WAEHREND
DER
DIFFERENZIERUNG
94
4.2.5.
IGFBP-2
EXPRESSION
WAEHREND
DER
DIFFERENZIERUNG
94
4.2.6.
IGFBP-3
EXPRESSION
WAEHREND
DER
DIFFERENZIERUNG
95
4.2.7.
IGFBP-4
EXPRESSION
WAEHREND
DER
DIFFERENZIERUNG
96
43.
SCHLUSSBETRACHTUNG
96
5.
ZUSAMMENFASSUNG
98
6.
LITERATURVERZEICHNIS
99
7.
ANHANG
120
8.
DANKSAGUNG
127 |
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