Molekulargenetische Untersuchungen der Glukose-Fruktose Oxidoreduktase aus Zymomonas mobilis:
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Jülich
Forschungszentrum Jülich GmbH, Zentralbibl.
1995
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INHALTSVERZEICHNIS
I.
EINLEITUNG
1
N.
MATERIAL
UND
METHODEN
1.
CHEMIKALIEN
UND
ENZYME
9
2.
BAKTERIENSTAEMME,
PLASMIDE,
PHAGEN
UND
OLIGONUKLEOTIDE
10
3.
NAEHRMEDIEN
UND
KULTIVIERUNGSBEDINGUNGEN
15
4.
MOLEKULARGENETISCHE
METHODEN
17
4.1
ALLGEMEINE
GENETISCHE
UND
REKOMBINANTE
DNA
TECHNIKEN
17
4.2
OLIGONUKLEOTIDSYNTHESE
19
4.3
AMPLIFIKATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
DURCH
DIE
POLYMERASE
KETTENREAKTION
19
4.4
DNA-SEQUENZIERUNG
NACH
SANGER
21
4.5
TNPHOA-MUTAGENESE
21
4.6
OLIGONUKLEOTID-GERICHTETE
MUTAGENESE
21
5.
BESTIMMUNG
VON
ENZYMAKTIVITAETEN
23
5.1
HERSTELLUNG
ZELLFREIER
ROHEXTRAKTE
23
5.2
BESTIMMUNG
DER
GLUKOSE-FRUKTOSE
OXIDOREDUKTASE
AKTIVITAET
23
5.3
BESTIMMUNG
DER
GLUKONOLACTONASEAKTIVITAET
25
6.
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
25
6.1
SDS-POLYACRYLAMID
GELELEKTROPHORESE
25
6.2
'WESTEM-BLOT'
25
6.3
SAURE
KATHODISCHE
ELEKTROPHORESE
26
6.4
LOKALISIERUNG
DER
GLUKOSE-FRUKTOSE
OXIDOREDUKTASE
IN
E.
COLI
26
DURCH
TRYPSINVERDAUS
6.5
REINIGUNG
DER
GLUKOSE-FRUKTOSE
OXIDOREDUKTASE
27
6.6
BESTIMMUNG
DER
CARBOXYTERMINALEN
AMINOSAEURE
DER
GLUKOSE-FRUKTOSE
28
OXIDOREDUKTASE
6.7
ANREICHERUNG
DER
GLUKONOLACTONASE
AUS
RHODOTORULA
RUBRA
28
7.
IN
VIVO
35
S-METHIONIN
MARKIERUNG
UND
IMMUNFAELLUNG
29
8.
DENATURIERUNG
DER
GLUKOSE-FRUKTOSE
OXIDOREDUKTASE
UND
FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE
30
IN.
ERGEBNISSE
32
1.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
PHYSIOLOGISCHEN
FUNKTION
DER
GLUKOSE-FRUKTOSE
32
OXIDOREDUKTASE
1.1
CHARAKTERISIERUNG
DES
Z.
MOBILIS
STAMMES
ACM3963
32
1.2
WACHSTUM
DER
GLUKOSE-FRUKTOSE
OXIDOREDUKTASE-DEFEKTMUTANTE
33
Z.
MOBILIS
ACM3963
BEI
HOHEN
ZUCKERKONZENTRATIONEN
1.3
AUSWIRKUNG
EINER
CYTOPLASMATISCHEN
LOKALISIERUNG
DER
GLUKOSE-FRUKTOSE
39
OXIDOREDUKTASE
AUF
DAS
WACHSTUM
BEI
HOHEN
ZUCKERKONZENTRATIONEN
2.
EXPRESSION
DES
GENS
DER
GLUKOSE-FRUKTOSE
OXIDOREDUKTASE
IN
E.
COLI
UND
Z.
MOBILIS
40
3.
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
EXPORT
DER
GLUKOSE-FRUKTOSE
OXIDOREDUKTASE
IN
Z.
MOBILIS
44
3.1
NACHWEIS
DER
PROZESSIERUNG
UND
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
EXPORTWEG
DER
44
GLUKOSE-FRUKTOSE
OXIDOREDUKTASE
IN
Z.
MOBILIS
3.2
CHARAKTERISIERUNG
VON
DELETIONSMUTANTEN
DER
SIGNALSEQUENZ
DER
GLUKOSE
45
FRUKTOSE
OXIDOREDUKTASE
3.3
REINIGUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
GLUKOSE-FRUKTOSE
OXIDOREDUKTASE
48
DELETIONSMUTANTE
A32-46
3.4
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
EXPORT
EINES
FUSIONSPROTEINS
AUS
REIFER
GLUKOSE-FRUKTOSE
49
OXIDOREDUKTASE
UND
SIGNALSEQUENZ
DER
GLUKONOLACTONASE
IN
Z.
MOBILIS
4.
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
EXPORT
DER
GLUKOSE-FRUKTOSE
OXIDOREDUKTASE
IN
E.
COLI
53
4.1
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
PROZESSIERUNG
UND
LOKALISIERUNG
DER
GLUKOSE-FRUKTOSE
53
OXIDOREDUKTASE
IN
E.
COLI
4.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
FUNKTIONALITAET
DER
SIGNALSEQUENZ
DER
GLUKOSE-FRUKTOSE
55
OXIDOREDUKTASE
IN
E.
COLI
DURCH
FUSIONEN
MIT
DER
ALKALISCHEN
PHOSPHATASE
AUSE.
COLI
4.3
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
EXPORT
VON
SIGNALSEQUENZ-AUSTAUSCHMUTANTEN
DER
57
GLUKOSE-FRUKTOSE
OXIDOREDUKTASE
IN
E.
COLI
5.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
NADP-BINDESTELLE
DER
GLUKOSE-FRUKTOSE
OXIDOREDUKTASE
59
5.1
DENATURIERUNGSEXPERIMENTE
UND
FLUORESZENZSPEKTROSKOPISCHE
UNTERSUCHUNGEN
60
ZUR
KOFAKTORBINDUNG
DER
GLUKOSE-FRUKTOSE
OXIDOREDUKTASE
5.2
ANALYSE
DER
SEKUNDAERSTRUKTUR
DER
GLUKOSE-FRUKTOSE
OXIDOREDUKTASE
61
5.3
MUTATIONEN
IN
DER
MOEGLICHEN
REGION
DER
NADP-BINDESTELLE
DER
63
GLUKOSE-FRUKTOSE
OXIDOREDUKTASE
5.4
MUTATIONEN
IN
EINER
KONSERVIERTEN
REGION
DER
GLUKOSE-FRUKTOSE
OXIDOREDUKTASE
65
5.5
REINIGUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
DER
GLUKOSE-FRUKTOSE
OXIDOREDUKTASE
68
MUTANTEN
GFOR-E180Q
UND
GFOR-C179S
IV.
DISKUSSION
71
1.
PHYSIOLOGISCHE
FUNKTION
DER
GLUKOSE-FRUKTOSE
OXIDOREDUKTASE
71
2.
EXPORT
DER
GLUKOSE-FRUKTOSE
OXIDOREDUKTASE
72
3.
CHARAKTERISIERUNG
DER
NADP-BINDESTELLE
DER
GLUKOSE-FRUKTOSE
OXIDOREDUKTASE
78
V.
ZUSAMMENFASSUNG
85
VI.
LITERATURVERZEICHNIS
87 |
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