Anreicherung und Charakterisierung der am Abbau von 4-Aminobenzolsulfonat beteiligten ringspaltenden Enzyme aus Hydrogenophaga palleronii und Agrobacterium radiobacter:
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4-AMINOBENZOLSULFONAT BETEILIGTEN RINGSPALTENDEN ENZYME AUS
HYDROGENOPHAGA PALLERONII UND AGROBACTERIUM RADIOBACTER VON DER FAKULTAET
GEO- UND BIOWISSENSCHAFTEN DER UNIVERSITAET STUTTGART ZUR ERLANGUNG DER
WUERDE EINES DOKTORS DER NATURWISSENSCHAFTEN (DR. RER. NAT.) GENEHMIGTE
ABHANDLUNG VORGELEGT VON ANGELA HAMMER AUS STUTTGART HAUPTBERICHTER:
PROF. DR. H.-J. KNACKMUSS MITBERICHTER: PROF. DR. C. SYLDATK TAG DER
MUENDLICHEN PRUEFUNG: 20.07.1995 INSTITUT FUER MIKROBIOLOGIE DER
UNIVERSITAET STUTTGART 1995 INHALTSVERZEICHNIS SEITE VERZEICHNIS DER
VERWENDETEN ABKUERZUNGEN ZUSAMMENFASSUNG 1. EINLEITUNG 14 1.1
EIGENSCHAFTEN UND VERWENDUNG AROMATISCHER AMINOBENZOLSULFONSAEUREN UND 15
IHRER DERIVATE 1.2 MIKROBIELLER ABBAU VON SULFANILAT (4ABS) 18 1.2.1 DIE
ENZYME DES SULFANILAT-ABBAUWEGES - 18 1.2.2 SYNERGISTISCHE
WECHSELWIRKUNGEN ZWISCHEN DEN STAEMMEN 21 SL UND S2 1.3 DIE
RINGSPALTENDEN ENZYME DES 3-OXOADIPAT-WEGES A 22 1.4 ZIELSETZUNG DER
VORLIEGENDEN ARBEIT 23 2. MATERIAL UND METHODEN 24 2.1 ORGANISMEN 24 2.2
STAMMHALTUNG UND REINHEITSKONTROLLE 24 2.3 NAEHRLOESUNGEN 25 2.3.1
MINERALMEDIUM 25 2.3.2 KOMPLEXMEDIEN 26 2.3.3 SPURENELEMENTE-LOESUNG 27
2.4 ANZUCHT VON BAKTERIENKULTUREN UND VERWENDETE FERMENTERANLAGEN 27
2.4.1 ANZUCHTEN MIT 1 1 KULTURVOLUMEN 27 2.4.2 ANZUCHT DER REINKULTUREN
MITTELS MEMBRANFERMENTER 28 2.4.3 ANZUCHTEN MIT 4 1 KULTURVOLUMEN 31 2.5
TRUEBUNGSMESSUNGEN 31 2.6 ZELLERNTE UND HERSTELLUNG ZELLFREIER EXTRAKTE
32 2.7 PROTEINBESTIMMUNG 32 2.8 BESTIMMUNG VON ENZYMAKTIVITAETEN 33 2.8.1
PROTOCATECHUAT-3,4-DIOXYGENASE(3,4DHB-UMSATZ) 33 2.8.2
PROTOCATECHUAT-3,4-DIOXYGENASE TYP II (4CS-UMSATZ) 33 2.9 BESTIMMUNG VON
ENZYMAKTIVITAETEN MITTELS SAUERSTOFFELEKTRODE 34 2.10 HPLC-ANALYSE DER
METABOLITE DES 4ABS-UND 3,4DHB-ABBAUS 35 2.11 ANREICHERUNG VON ENZYMEN
37 2.11.1 AMMONIUMSULFAT-FRAKTIONIERUNG * 37 2.11.2
SAEULENCHROMATOGRAPHIE 38 2.11.3 ULTRAFILTRATION 40 2.12 ABSCHAETZUNG DES
MOLEKULARGEWICHTES VON PROTEINEN DURCH GELFILTRATION 40 2.13
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE(PAGE) 41 2.13.1 SDS-PAGE 41 2.13.2 NATIVE
ELEKTROPHORESE 44 2.14 TRANSFER VON PROTEINEN AUF MEMBRANEN 45 2.15
AMINOSAEURE-SEQUENZIERUNG 46 2.16 SYNTHESE VON BRENZKATECHIN-4-SULFONAT
(4CS) 47 2.17 UV-SPEKTROSKOPIE 47 2.18 CHEMIKALIEN UND BIOCHEMIKALIEN 47
3. ERGEBNISSE 49 3.1 ANREICHERUNG DER ISOFIINKTIONELLEN
PROTOCATECHUAT-3,4-DIOXYGENASEN 49 AUS HYDROGENOPHAGA PALLERONII STAMM
SL UND AGROBACTERIUM RADIO- BACTER STAMM S2 3.1.1 ENTWICKLUNG DER
REINIGUNGSSTRATEGIE 50 3.1.2 ANREICHERUNG DER
PROTOCATECHUAT-3,4-DIOXYGENASE VOM TYP I AUS 51 AGROBACTERIUM
RADIOBACTER STAMM S2 3.1.3 ANREICHERUNG DER
PROTOCATECHUAT-3,4-DIOXYGENASE VOM TYP II AUS 54 AGROBACTERIUM
RADIOBACTER STAMM S2 3.1.4 ANREICHERUNG DER
PROTOCATECHUAT-3,4-DIOXYGENASE VOM TYP II AUS 62 HYDROGENOPHAGA
PALLERONII STAMM SL 3.1.4.1 ERSTE ANREICHERUNG DER
PROTOCATECHUAT-3,4-DIOXYGENASE TYP II (P34OII) 62 3.1.4.2 WEITERE
REINIGUNG DER PROTOCATECHUAT-3,4-DIOXYGENASE TYP II (P34OII) 65 3.2
CHARAKTERISIERUNG DER PROTOCATECHUAT-3,4-DIOXYGENASE VOM TYP I AUS AGRO-
71 BACTERIUM RADIOBACTER STAMM S2 3.2.1 BESTIMMUNG DER RELATIVEN
MOLEKULARGEWICHTE DES HOLOENZYMS UND 71 DER ENZYMUNTEREINHEITEN 3.2.2
ABSORPTIONSSPEKTRUM DER GEREINIGTEN PROTOCATECHUAT-3,4-DIOXYGENASE 73
VOM TYP I DES STAMMES S2 3.2.3 BESTIMMUNG DER AMINOTERMINALEN
AMINOSAEURESEQUENZEN DER BEIDEN 74 UNTEREINHEITEN DER
PROTOCATECHUAT-3,4-DIOXYGENASE VOM TYP I DES STAMMES S2 3.2.4 BESTIMMUNG
DER SUBSTRATSPEZIFITAET DER PROTOCATECHUAT-3,4-DIOXYGENASE 74 VOM TYP I
DES STAMMES S2 3.2.4.1 UMSATZ VON PROTOCATECHUAT (3.4DHB) ZU
3-CARBOXY-CW,CW-MUCONAT 74 (3CM) 3.2.4.2 UMSATZ VON (SUBSTITUIERTEN )
BRENZKATECHINEN UND (SUBSTITUIERTEN) 76 BENZOATEN 3.2.5 BESTIMMUNG DER
KINETISCHEN PARAMETER DER PROTOCATECHUAT-3,4-DIOXY- 78 GENAESE VOM TYP I
DES STAMMES S2 FUER DIE SUBSTRATE 3.4DHB UND SAUERSTOFF 3.3
CHARAKTERISIERUNG DER PROTOCATECHUAT-3,4-DIOXYGENASEN VOM TYP II AUS
HYDRO- 81 GENOPHAGAPALLERONII STAMM SL UND AGROBACTERIUM RADIOBACTER
STAMM S2 3.3.1 BESTIMMUNG DER RELATIVEN MOLEKULARGEWICHTE DER
PROTOCATECHUAT-3,4- 81 DIOXYGASEN VOM TYP II DER STAEMME S2 UND SL UND
IHRER UNTER- EINHEITEN 3.3.1.1 PROTOCATECHUAT-3,4-DIOXYGENASE TYP II
(P34OII) DES STAMMES S2 81 3.3.1.2 PROTOCATECHUAT-3,4-DIOXYGENASE TYP II
(P34OII) DES STAMMES SL 82 3.3.2 ABSORPTIONSSPEKTRUM DER GEREINIGTEN
PROTOCATECHUAT-3,4-DIOXYGENAESE 84 VOM TYP II DES STAMMES S2 3.3.3
BESTIMMUNG DER AMINOTERMINALEN AMINOSAEURESEQUENZEN DER UNTER- 86
EINHEITEN DER PROTOCATECHUAT-3,4-DIOXY GENASEN VOM TYP II DER STAEMME SL
UND S2 3!3.4 VERSUCH ZUR HEMMUNG DER PROTOCATECHUAT-3,4-DIOXYGENASEN VOM
TYP 89 II DER STAEMME SL UND S2 DURCH TIRON
(BRENZKATECHIN-3,5-DISULFONSAEURE) 3.3.5 BESTIMMUNG DER
SUBSTRATSPEZIFITAETEN DER PROTOCATECHUAT-3,4-DIOXYGE- 90 NASEN VOM TYP II
DER STAEMME SL UND S2 3.3.5.1 UMSATZ VON BRENZKATECHIN-4-SULFONAT (4CS)
90 3.3.5.2 UMSATZ VON (SUBSTITUIERTEN) BRENZKATECHINEN UND
(SUBSTITUIERTEN) 92 BENZOATEN 3.3.6 REAKTIONSKINETISCHE UNTERSUCHUNGEN
DER PROTOCATECHUAT-3,4-DIOXYGE- 99 NASEN VOM TYP II DER STAEMME S1 UND S2
3.3.6.1 BESTIMMUNG DER KINETISCHEN PARAMETER DER
PROTOCATECHUAT-3,4-DIOXY- 99 GENASEN TYP II (P34OII) FUER DIE ORGANISCHEN
SUBSTRATE 3.4DHB UND 4CS 3.3.6.2 UMSATZ VON 4CS DURCH DIE
PROTOCATECHUAT-3,4-DIOXYGENASEN TYP II 102 (P34OII) IN GEGENWART VON
3.4DHB UND VICE VERSA 3.3.6.3 BESTIMMUNG DER KINETISCHEN PARAMETER DER
PROTOCATECHUAT-3,4-DIOXY- 107 GENASEN TYP II (P34OII) GEGENUEBER
SAUERSTOFF BEIM UMSATZ VON 4CS UND3,4DHB 4. DISKUSSION 116 4.1 AEROBER
ABBAU VON ARYLSULFONATEN 116 4.1.1 DIE BEKANNTEN
DESULFONIENINGSMECHARUESMEN 116 4.1.2 DIE INITIALE DIOXYGENIERUNG 117 4.2
VERGLEICH DER ISOFUNKTIONELLEN PROTOCATECHUAT-3,4-DIOXYGENASEN AUS
HYDRO- 118 GENOPHAGA STAMM SL UND AGROBACTERIUM RADIOBACTER STAMM S2 MIT
ANDEREN INTRADIOL SPALTENDEN DIOXYGENASEN 4.2.1 PHYSIKALISCHE
EIGENSCHAFTEN 120 4.2.2 KATALYTISCHE EIGENSCHAFTEN 126 4.2.2.1
SUBSTRATSPEZIFITAETEN 126 4.2.2.2 MECHANISTISCHE ASPEKTE 126 4.2.2.3
ZUSAMMENHAENGE ZWISCHEN DER 4CS-AKKUMULATION UND DEN AFFINITAETEN 133 DER
PROTOCATECHUAT-3,4-DIOXYGENASE TYP II DES STAMMES SL GEGENUEBER 4CS UND
SAUERSTOFF 4.3 AUSBLICK 135 5. LITERATURVERZEICHNIS 137
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