Molekulare und funktionelle Charakterisierung Zyklonukleotid-aktivierter Kationenkanäle aus nicht-sensorischen Zellen:
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1995
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2
INHALTSVERZEICHNIS
LISTE DER ABKUERZUNGEN 4
1. EINLEITUNG 5
1.1 CNG-KANAELE IN DEN SIGNALTRANSDUKTIONSWEGEN DES SEH- UND
RIECHPROZESSES 6
1.1.1 SIGNALTRANSDUKTION DES SEH- UND RIECHPROZESSES 6
1.1.2 CNG-KANAELE BILDEN EINE MULTI-GENFAMILIE 7
1.1.3 STRUKTUR VON CNG-KANAELEN 9
1.1.4 AKTIVIERUNG VON CNG-KANAELEN DURCH ZYKLISCHE NUKLEOTIDE 12
1.1.5 MODULATORISCHE CNG-KANALUNTEREINHEITEN 12
1.2 ZIEL DER ARBEIT 14
2. METHODEN 15
2.1 ISOLIERUNG VON POLY (A
+)-RNA 15
2.2 KONSTRUKTION VON CDNA-BIBLIOTHEKEN IN E. COLI 15
2.3 IDENTIFIZIERUNG SPEZIFISCHER KLONE 16
2.4 ANALYSE DER CDNA-KLONE 16
2.5 NORTHEM-BLOT 16
2.6 PCR-GESTUETZTE AMPLIFIZIERUNG UND KLONIERUNG SPEZIFISCHER SEQUENZEN
17
2.7 EXPRESSION VON CNG-KANAELEN IN HEK293-ZELLEN 18
2.7.1 ZELLKULTUR 18
2.7.2 KONSTRUKTION VON EXPRESSIONSVEKTOREN 18
2.7.2.1 PCG153/CMV UND PCG357/CMV 18
2.7.2.2 PCGK26/CMV 19
2.7.2.3 PCNG4D-E/CMV 19
2.7.3 TRANSIENTE EXPRESSION 20
2.8 HERSTELLUNG VON ANTIKOERPERN 20
2.9 WESTERN-BLOT 21
2.10 ELEKTROPHYSIOLOGISCHE MESSUNGEN 21
2.11 SEQUENZEN DER VERWENDETEN PRIMER 22
2.12 ZUSAMMENSETZUNG EINIGER PUFFER 22
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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3
3. ERGEBNISSE 23
3.1 KLONIERUNG VON CNG-KANAELEN AUS DER KANINCHENAORTA (RACNG) UND 23
DER RINDEMIERE (CNG3)
3.1.1 AMPLIFIZIERUNG VON PARTIELLEN CNG-KANALSEQUENZEN 23
3.1.2 ISOLIERUNG DER VOLLSTAENDIGEN CDNA VON CNG-KANAELEN AUS AORTA 24
UND NIERE
3.2 FUNKTIONELLE EXPRESSION VON RACNG UND CNG3 IN HEK293-ZELLEN 27
3.2.1 STROMAKTIVIERUNG DURCH CGMP UND CAMP 27
3.2.2 LEITFAEHIGKEIT VON CNG3 UND RACNG FUER MONOVALENTE KATIONEN 30
3.2.3 EINSTROM VON CA
2+DURCH DEN CNG3-KANAL 30
3.3 UNTERSUCHUNGEN ZUR GEWEBSEXPRESSION VON CNG-KANAELEN 33
3.3.1 NORTHEM-BLOT-ANALYSE DER EXPRESSION VON CNG3 33
3.3.2 PCR-AMPLIFIKATION VON CNG-KANALSEQUENZEN 35
3.4 KLONIERUNG UND EXPRESSION EINER MODULATORISCHEN UNTEREINHEIT 39
DES CNG-KANALS
3.4.1 KLONIERUNG DER CDNA VON CNG4C-E 39
3.4.2 PRIMAERSTRUKTUR VON CNG4C-E 40
3.4.3 GEWEBSEXPRESSION VON CNG4 43
3.4.4 BILDUNG HETEROOLIGOMERER KANAELE AUS CNG3 UND CNG4 45
3.4.4.1 NACHWEIS DER CNG3- UND CNG4-PROTEINE 45
3.4.4.2 ELEKTROPHYSIOLOGISEHE EIGENSCHAFTEN DES HETEROOLIGOMEREN KANALS
46
3.4.4.2.1 KANALBLOCK DURCH L-CIS DILTIAZEM 47
3.4.4.2.2 EINZELKANALEIGENSCHAFTEN 48
3.4.4.2.3 AKTIVIERUNG DURCH ZYKLISCHE NUKLEOTIDE 49
3.4.4.2.4 SPANNUNGSABHAENGIGER KANALBLOCK DURCH CA
2+ 49
3.4.4.2.5 LEITFAEHIGKEIT FUER CA
2+ 50
3.5 MODULATION HOMO- UND HETEROOLIGOMERER KANAELE DURCH CA
2+-CALMODULIN 51
3.5.1 SENKUNG DER AFFINITAET ZU ZYKLISCHEN NUKLEOTIDEN 51
3.5.2 POTENZIERUNG DER WIRKUNG VON KANALBLOCKEM 53
4. DISKUSSION §6
5. LITERATURVERZEICHNIS 68
6. ZUSAMMENFASSUNG 77 |
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