Zellbiologische Charakterisierung Membran- und Kernmatrix-assoziierter Proteine der humanen Osteosarkomzellinie MG63:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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1995
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
.
1
1.1.
MONOKLONALE
ANTIKOERPER
.
1
1.2.
OSTEOBLASTEN
.
3
YY
1.2.1.
DIE
OSTEOSARKOM-ZELLINIEN
HOS(TE85)
UND
MO63.
4
1.3.
AUFGABENSTELLUNG
.
5
1.4.
DAS
ER-GOLGI
INTERMEDIAER
KOMPARTIMENT
.
6
2.
ZUSAMMENFASSUNG
.
12
3.
MATERIAL
.
15
3.1.
CHEMIKALIEN
.
15
3.2.
ENZYME
.
15
3.3.
MATERIALIEN
.
15
3.4.
GERAETE
.
15
3.5.
PUFFER,
MEDIEN
UND
LOESUNGEN
.
16
3.6.
BAKTERIENSTAEMME
.
18
3.7.
ZELLINIEN
.
18
3.8.
ANTIKOERPER
.
19
4.
METHODEN
.
20
4.1.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
20
4.1.1.
ISOLATION
VON
PLASMID
DNA
.
20
4.1.1.1.
CTAB
MINILYSE
.
20
4.1.1.2.
ISOLATION
GROSSER
DNA
MENGEN
(MAXI
PRAEPARATION)
.
21
4.1.2.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
21
4.1.3.
HYDROLYSE
VON
PLASMID
DNA
DURCH
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
21
4.1.4.
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
.
22
4.1.5.
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
22
4.1.6.
TRANSFORMATION
CHEMISCH
KOMPETENTER
E.
COLI
.
23
4.1.7.
HERSTELLUNG
ELEKTROKOMPETENTER
E.
COLI
(MC1061-P3)
.
23
4.1.8.
TRANSFORMATION
VON
E.COLI
(MC-1061
P3)
DURCH
ELEKTROPORATION
.
24
4.1.9.
DNA-SEQUENZIERUNG
.
24
4.1.9.1.
SEQUENZIERREAKTION
UND
GELLAUF
.
25
4.1.9.2.
COLORIMETRISCHE
ENTWICKLUNG
DER
DIGOXIGENIN
MARKIERTEN
DNA
.
25
4.1.10.
IN
VITRO
TRANSKRIPTION/TRANSLATION
.
26
4.1.11.
SCREENING
EINER
MG63-GENBANK
DURCH
LIGANDEN
AFFINITAETS
KLONIERUNG
(PANNING)
.
26
4.1.11.1.
DEAE-DEXTRAN
TRANSFEKTION
VON
COS-ZELLEN
.
27
4.1.11.2.
SELEKTION
DER
TRANSFIZIERTEN
COS
ZELLEN
(PANNING)
.
28
4.1.11.3.
ISOLIERUNG
DER
EPISOMALEN
CDNA
(HIRT
EXTRAKTION)
.
29
4.1.11.4.
AMPLIFIKATION
DER
ISOLIERTEN
CDNA
UND
ERNEUTE
TRANSFEKTION
VON
COS-ZELLEN
.
30
4.2.
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
.
33
4.2.1.
METHANOLFAELLUNG
.
33
4.2.2.
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
NACH
BRADFORD
.
33
4.2.3.
SDS-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
33
4.2.4.
ZWEIDIMENSIONALE
GELELEKTROPHORESE
VON
PROTEINEN
.
34
4.2.5.
ISOELEKTRISCHE
FOKUSSIERUNG
(IEF)
.
36
4.2.6.
SILBERFAERBUNG
VON
PROTEINGELEN
.
36
4.2.7.
TRANFER
VON
PROTEINEN
AUF
NITROZELLULOSE
UND
IMMUNOLOGISCHE
NACHWEISREAKTION
(IMMUNBLOT)
.
37
4.2.7.
L.TRANSFER
.
37
4.2.7.2.
INKUBATION
MIT
ANTIKOERPERN
.
37
4.2.8.
DIALYSE
VON
PROTEINPROBEN
.
39
4.2.9.
AUFKONZENTRATION
VON
PROTEINPROBEN
DURCH
ULTRAFILTRATION
.
39
4.2.10.
ISOLATION
VON
MEMBRANFRAKTIONEN
AUS
KULTURZELLEN
.
40
4.2.11.
HERSTELLUNG
VON
GEWEBEEXTRAKTEN
AUS
MAUS
UND
ZEBRAFINK
.
41
4.2.11.1.
SELEKTIVE
EXTRAKTION
VON
KULTURZELLEN
.
41
4.2.12.
TRITON
X-114
EXTRAKTION
.
42
4.2.13.
ANALYSE
VON
TRANSMEMBRANPROTEINEN
DURCH
PROTEASE
VERDAU
(PROTEASE
PROTECTION
ASSAY)
.
42
4.2.14.
IN
VITRO
REKONSTITUTION
VON
VIMENTIN
UND
DESMIN
INTERMEDIAERFILAMENTEN
.
42
4.2.15.
HERSTELLUNG
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
.
43
4.2.15.1.
IMMUNISIERUNG
.
43
4.2.15.2.
FUSION
DER
MILZZELLEN
MIT
MYELOMZELLEN
.
43
4.2.15.3.
SUBKLONIERUNG
DER
HYBRIDOMKLONE
.
45
4.2.15.4.
BESTIMMUNG
DER
IMMUNGLOBULIN
SUBKLASSE
.
45
4.2.16.
IMMUNPRAEZIPITATION
.
46
4.2.17.
QUANTITATIVE
BESTIMMUNG
DER
OBERFLAECHENFLUORESZENZ
MITTELS
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
.
47
4.2.18.
AUFREINIGUNG
REKOMBINANTER
PROTEINE
MITTELS
NI-CHCLAT
CHROMATOGRAPHIE
.
48
4.2.19.
KOPPLUNG
VON
PROTEINEN
AN
CNBR-AKTIVIRTE
SEPHAROSE
.
49
4.2.20.
AFFINITAETSREINIGUNG
VON
IMMUNGLOBULINEN
AUS
KANINCHENSEREN
.
49
4.2.21.
IMMUNFLUORESZENZ
.
50
4.3.
ZELLKULTUR
.
50
4.3.1.
KULTURBEDINGUNGEN
.
50
4.3.2.
BESTIMMUNG
DER
ZELLZAHL
.
51
4.3.3.
MEDIENWECHSEL
UND
TEILUNG
VON
KULTURZELLEN'.
.
51
4.3.4.
EINFRIEREN
UND
AUFTAUEN
VON
KULTURZELLEN
.
52
5.
ERGEBNISSE
.
53
5.1.
HERSTELLUNG
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
GEGEN
PROTEINE
AUS
MEMBRANFRAKTIONEN
VON
MG63-ZELLEN
.
53
5.1.1.
CHARAKTERISIERUNG
DER
MEMBRANFRAKTIONEN
.
53
5.1.2.
CHARAKTERISIERUNG
DER
MONOKLONALEN
ANTIKOERPER
.
54
5.2.
LIGANDEN-AFFINITAETS-SCREENING
EINER
MG63
OSTEOBLASTEN
GENBANK
(PANNING)
.
57
5.3.
CHARAKTERISIERUNG
VON
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN
DURCH
X-ZAP
SCREENING
.
63
5.4.
CHARAKTERISIERUNG
DES
MONOKLONALEN
ANTIKOERPERS
C8.A2
.
65
5.4.1.
IMMUNCHEMISCHE
UNTERSUCHUNG
DES
C8.A2-ANTIGENS
.
65
5.4.2.
FLUORESZENZMIKROSKOPISCHE
LOKALISIERUNG
DES
C8.A2
ANTIGENS
.
69
5.5.
CHARAKTERISIERUNG
EINES
NEUEN
PROTEINS
-P87/89
DES
ER-GOLGI
INTERMEDIAER-KOMPARTIMENTS
(IK)
.
71
5.5.1.
SEQUENZANALYSE
.
71
5.5.2.
HERSTELLUNG
EINES
AFLINITAETSGEREINIGTEN
POLYKLONALEN
ANTIKOERPERS
GEGEN
P87
/89
.
74
5.5.3.
NACHWEIS
VON
P87/89
SPLICE-VARIANTEN
.
76
5.5.4.
NORTHEMBLOT-ANALYSE
DES
P87/89
.
77
5.5.5.
NACHWEIS
VERSCHIEDENER
P87/89
ISOFORMEN
IN
GEWEBEEXTRAKTEN
UND
ZELLINIEN
.
78
5.5.6.
AUFKLAERUNG
DER
MEMBRANORIENTIERUNG
VON
P87/89
.
81
5.5.7.
IMMUNFLUORESZENZMIKROSKOPISCHE
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
LOKALISIERUNG
VON
P87/89
.
84
5.5.8.
EINFLUSS
VON
BREFELDIN
A,
NOCODAZOL
UND
15
'
C
BEHANDLUNG
AUF
DIE
LOKALISIERUNG
VON
P87/89
.
86
5.5.9.
P87/89
ASSOZIATION
MIT
VIMENTIN
INTERMEDIAER
FILAMENTEN
.
90
5.5.10.
KOPOLYMERISATION
VON
REKOMBINANTEN
IF
MIT
P87/89
.
94
5.5.11.
ANALYSE
VON
KANINCHEN-MYOFIBRILLEN
.
95
6.
DISKUSSION
.
98
6.1.
CHARAKTERISIERUNG
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
DURCH
LIGANDEN
AFIINITAETS-SCREENING
.
98
6.2.
CHARAKTERISIERUNG
VON
NDP52
.
102
6.3.
CHARAKTERISIERUNG
VON
P87/89
.
103
7.
LITERATURVERZEICHNIS
.
110
8.
ANHANG
.
119
8.1.
CHARAKTERISIERUNG
DER
MAK
.119
8.2.:
KLONIERUNGSSCHEMA
DER
MG63-CDNA
GENBANK
IN
PCDM8
.
121
8.3.
HOMOLOGIESUCHE
DER
PHAGENKLONE
DER
MAK
C8.B6,
C8.A4,
D6.B3
.
122
8.4.
CDNA
SEQUENZ
UND
ABGELEITETE
AMINOSAEURESEQUENZ
VON
NDP52
.124 |
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| spelling | Gieffers, Christian Verfasser aut Zellbiologische Charakterisierung Membran- und Kernmatrix-assoziierter Proteine der humanen Osteosarkomzellinie MG63 vorgelegt von Christian Gieffers 1995 124 S. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Bielefeld, Univ., Diss. Proteine (DE-588)4076388-2 gnd rswk-swf Zelllinie (DE-588)4231928-6 gnd rswk-swf Osteosarkom (DE-588)4172929-8 gnd rswk-swf Mensch (DE-588)4038639-9 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Mensch (DE-588)4038639-9 s Osteosarkom (DE-588)4172929-8 s Zelllinie (DE-588)4231928-6 s Proteine (DE-588)4076388-2 s DE-604 DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=007124725&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
| spellingShingle | Gieffers, Christian Zellbiologische Charakterisierung Membran- und Kernmatrix-assoziierter Proteine der humanen Osteosarkomzellinie MG63 Proteine (DE-588)4076388-2 gnd Zelllinie (DE-588)4231928-6 gnd Osteosarkom (DE-588)4172929-8 gnd Mensch (DE-588)4038639-9 gnd |
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| title | Zellbiologische Charakterisierung Membran- und Kernmatrix-assoziierter Proteine der humanen Osteosarkomzellinie MG63 |
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