Untersuchungen zur Charakterisierung von Naturherden des Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus (FSMEV) in Deutschland mit Hilfe von molekularbiologischen und konventionellen virologischen Methoden:
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1.
EINLEITUNG
1
1.1.
AETIOLOGIE
DER
ERKRANKUNG
3
1.1.1.
TAXONOMIE
DES
ERREGERS
3
1.1.2.
MORPHOLOGIE
DES
VIRIONS
5
1.1.3.
AUFBAU
DES
VIRALEN
GENOMS
8
1.2.
OEKOLOGIE
DES
ERREGERS
10
1.2.1.
DER
NATURHERD
10
1.2.2.
DIE
VEKTOREN
10
1.2.2.1.
MORPHOLOGIE
DER
SCHILDZECKEN
11
1.2.2.2.
ENTWICKLUNG
VON
IXODES
RICINUS
12
1.2.2.3.
INFEKTIONSMECHANISMEN
13
1.2.3.
DIE
WIRBELTIERWIRTE
17
1.3.
KLINISCHES
BILD
DER
ERKRANKUNG
21
1.3.1.
KRANKHEITSVERLAUF
BEIM
MENSCHEN
21
1.3.2.
KRANKHEITSVERIAUF
BEIM
TIER
22
1.3.3.
DIAGNOSE
22
1.4.
EPIDEMIOLOGIE
DER
FSME
IN
DEUTSCHLAND
24
1.4.1.
EPIDEMIOLOGIE
DER
FSME
IN
DEN
ALTEN
BUNDESLAENDERN
24
1.4.2.
EPIDEMIOLOGIE
DER
FSME
IN
DEN
NEUEN
BUNDESLAENDERN
26
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
29
2.1.
FSME-VIRUSNACHWEIS
IN
DER
ZELLKULTUR
30
2.1.1.
MATERIAL
30
2.1.2.
METHODEN
30
2.1.2.1.
HERSTELLUNG
DER
ZELLKULTUREN
.
30
2.1.2.2.
FSME-VIRUSANZUCHT
30
2.1.2.3.
INDIREKTER
IMMUNFLUORESZENZ-TEST
31
2.1.2.4.
NEUTRALISATIONSTEST
32
2.1.2.5.
FSME-VIRUSTITRATION
33
2.2.
FSME-VIRUSNACHWEIS
IM
TIERVERSUCH
34
2.2.1.
MATERIAL
34
2.2.2.
METHODEN
34
2.2.2.1.
INFEKTION
DER
MAEUSESAEUGLINGE
34
2.2.2.2.
TOETUNG
DER
MAEUSE
UND
GEHIMENTNAHME
34
2.3.
NACHWEIS
DER
FSMEV-RNA
37
2.3.1.
MATERIAL
37
2.3.2.
METHODEN
37
2.3.2.1.
RNA-ISOLIERUNG
DURCH
SDS-ZUGABE
UND
PROTEINASE
K
VERDAUUNG
37
2.3.2.2.
RNA-ISOLIERUNG
DURCH
GUANIDINIUM-ISOTHIOCYANAT
UND
ORGANISCHE
LOESUNGSMITTEL
37
2.3.2.3.
REVERSE
TRANSKRIPTION
(RT)
38
2.3.2
4.
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
40
2.3.2.5.
AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE
DER
PCR-PRODUKTE
41
2.3.2.6.
RESTRIKTIONSENZYMANALYSE
41
2.3.2.7.
AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE
DER
SPALTPRODUKTE
DES
RESTRIKTIONSENZYMS
42
2.3.2.8.
SOUTHERN
BLOT
HYBRIDISIERUNG
42
2.4.
DNA-SEQUENZIERUNG
45
2.4.1.
MATERIAL
45
2.4.2.
METHODEN
45
2.4.2.1.
STRANGTRENNUNG
DER
PCR-PRODUKTE
45
2.4.2.2.
SEQUENZIERUNGSREAKTION
46
2.4.2.3.
POLYACRYLAMIDGEL-ELEKTROPHORESE
47
2.4.2.4.
CHEMILUMINESZENZ-NACHWEIS
DER
DNA-FRAGMENTE
48
2.5.
SICHERHEITSMASSNAHMEN
IM
RAHMEN
DER
PCR
49
2.6.
PUFFER
UND
REAGENZIEN
50
2.7.
AUSRUESTUNGEN
58
3.
ERGEBNISSE
60
3.1.
FSME-VIRUSNACHWEIS
IN
DER
ZELLKULTUR
60
3.1.1.
ISOLIERUNG
VON
FELDVIRUSSTAEMMEN
60
3.1.2.
IDENTIFIZIERUNG
DER
VIRUSSTAEMME
60
3.1.3.
FSME-VIRUSTITRATION
62
3.2.
FSME-VIRUSNACHWEIS
IM
TIERVERSUCH
63
3.3.
NACHWEIS
DER
FSMEV-RNA
64
3.3.1.
GROESSE
DER
AMPLIFIZIERTEN
PRODUKTE
64
3.3.2.
SPEZIFITAET
DER
PCR
65
3.3.3.
IDENTITAET
DER
AMPLIFIZIERTEN
PRODUKTE
70
3.3.3.1.
RESTRIKTIONSENZYMANALYSE
70
3.3.3.2.
SOUTHERN
BLOT
HYBRIDISIERUNG
70
3.3.4.
ABGRENZUNG
VON
WEITEREN
ARBOVIREN
71
3.3.5.
LEISTUNGSFAEHIGKEIT
VON
PCR
UND
SOUTHERN
BLOT
73
3.3.5.1.
FSME-VIRUSNACHWEIS
IN
EINZELZECKEN
73
3.3.5.2
SENSITIVITAETSVERGLEICH
VON
AEUSSERER
UND
INNERER
PCR
UND
SOUTHERN
BLOT
HYBRIDISIERUNG
73
3.3.6.
NACHWEIS
VON
FELDVIRUS-RNA
80
3.4.
DNA-SEQUENZIERUNG
DER
PCR-AMPLIFIKATE
84
4.
DISKUSSION
87
4.1.
FSMEV-NACHWEIS
MIT
KONVENTIONELLEN
VIROLOGISCHEN
METHODEN
88
4.2.
NACHWEIS
DER
FSMEV-RNA
90
4.2.1.
SPEZIFITAET
DER
PCR
90
4.2.2.
SENSITIVITAET
DER
PCR
91
4.3.
FSME-VIRUSNACHWEIS
IN
WILDZECKEN
95
4.4.
SEQUENZIERUNG
DER
PCR-AMPLIFIKATE
102
5.
ZUSAMMENFASSUNG
107
6.
SUMMARY
109
7.
LITERATURVERZEICHNIS
111 |
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