Proteintranslokation in Escherichia coli: Diskriminierung zwischen Sec-abhängiger und Sec-unabhängiger Translokation anhand von M13 Procoat und M13 Procoat-Mutanten
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IN
INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
EINLEITUNG
1
1.
DAS
SIGNALPEPTID
.
1
2.
DIE
ZELLULAERE
SEKRETIONSMASCHINERIE
VON
ESCHERICHIA
COLI
.
2
2.1
PRAEKURSOR-CHAPERON
INTERAKTIONEN
.
3
2.2
PRAEKURSOR-MEMBRAN
INTERAKTIONEN
.
4
2.3
DIE
SEC-ABHAENGIGE
TRANSLOKATION
AM
BEISPIEL
VON
PROOMPA
.
6
3.
DIE
SEC-UNABHAENGIGE
TRANSLOKATION
AM
BEISPIEL
VON
M13
PROCOAT
.
8
3.1
DER
BAKTERIOPHAGE
M13
.
8
3.2
DIE
TRANSLOKATION
VON
M13
PROCOAT
.
9
4.
PROBLEMSTELLUNG
.
11
MATERIALIEN
13
1.
BEZUGSQUELLEN
DER
CHEMIKALIEN
UND
ARBEITSMITTEL
.
13
2.
RADIOCHEMIKALIEN
.
14
3.
BAKTERIENSTAEMME,
PLASMIDE
UND
BAKTERIOPHAGENVEKTOREN
.
15
4.
ANTIKOERPER
.
16
5.
KULTURMEDIEN
.
16
6.
PUFFER
.
17
METHODEN
20
1.
ALLGEMEINE
ARBEITSMETHODEN
.
20
1.1
BESTIMMUNG
DER
NUKLEINSAEUREKONZENTRATION
.
20
1.2
EXTRAKTION
VON
NUKLEINSAEUREN
.
20
1.3
FAELLUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
20
1.4
AUF
TRENNUNG
VON
DNS
DURCH
GELELEKTROPHORESE
.
20
1.4.1
AGAROSEGEL
.
20
1.4.2
POLYACRYLAMIDGEL
.
20
1.5
ISOLIERUNG
VON
DNS
.
21
1.5.1
ISOLIERUNG
AUS
AGAROSEGELEN
MIT
PHENOL
.
21
1.5.2
ISOLIERUNG
AUS
AGAROSEGELEN
MIT
DEAE-MEMBRANEN
.
21
1.5.3
ISOLIERUNG
AUS
POLYACRYLAMIDGELEN
.
22
1.6
REINIGUNG
VON
DNS
.
22
1.7
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNS
AUS
REKOMBINANTEN
BAKTERIEN
.
22
1.7.1
PRAEPARATION
IM
KLEINEN
MASSSTAB
.
22
1.7.2
PRAEPARATION
IM
GROSSEN
MASSSTAB
.
23
1.8
PRAEPARATION
VON
DOPPELSTRAENGIGER
M13-DNS
(RF-FORM)
.
23
1.9
DNS-SEQUENZIERUNG
NACH
DER
KETTENABBRUCHMETHODE
.
24
1.10
HERSTELLUNG
UND
TRANSFORMATION
VON
KOMPETENTEN
BAKTERIEN
.
24
1.11
ELEKTROPORATION
.
24
1.12
TRANSFEKTION
.
25
IV
1.13
ANZUCHT
VON
M13-BAKTERIOPHAGEN
.
25
1.14
BESTIMMUNG
DES
PHAGENTITERS
.
25
1.15
PRAEPARATION
VON
ZELLEXTRAKTEN
.
25
1.15.1
HERSTELLUNG
VON
S-30
ZELLEXTRAKTEN
.
25
1.15.2
HERSTELLUNG
VON
S
135
ZELLEXTRAKTEN
.
26
1.15.3
IMMUNREAKTION
VON
SECA
AUS
E.
COLI
MM66
S-135
ZELLEXTRAKTEN
.
26
1.16
IN
VITRO
PROTEINSYNTHESE
IN
S-135
ZELLEXTRAKTEN
.
26
1.17
PRAEPARATION
VON
"INSIDE-OUT"
ZYTOPLASMAMEMBRANVESIKELN
(INV)
.
27
1.18
HERSTELLUNG
VON
MM66
H-INV
.
28
1.19
AUFTRENNUNG
VON
PROTEINEN
UEBER
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
UND
AUTORADIOGRAPHIE
.
28
1.20
COOMASSIEBLAU-FAERBUNG
VON
PROTEINEN
.
29
1.21
SILBERFAERBUNG
VON
PROTEINEN
.
29
1.22
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
.
29
1.23
WESTEM-BLOT
ANALYSE
.
29
2.
DNS-KLONIERUNGSTECHNIKEN
.
30
2.1
FRAGMENTIERUNG
VON
DNS
DURCH
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
30
2.2
LIGATION
VON
DNS-FRAGMENTEN
.
30
2.3
OLIGONUKLEOTID-MUTAGENESE
.
31
2.3.1
PRAEPARATION
VON
SSDNS-TEMPLATE
.
31
2.3.2
REINIGUNG
DER
OLIGONUKLEOTID-DNS
.
32
2.3.3
BESTIMMUNG
DER
OLIGONUKLEOTID-KONZENTRATION
.
32
2.3.4
OLIGONUKLEOTIDPHOSPHORYLIERUNG
.
33
2.3.5
OLIGOHYBRIDISIERUNG,
ELONGATION
UND
LIGATION
.
33
3.
REINIGUNG
VON
SECA
.
33
4.
ANALYTISCHE
METHODEN
.
34
4.1
NACHWEIS
DER
PROTEINTRANSLOKATION
IN
VIVO
.
34
4.1.1
PULSE-CHASE
ANALYSE
.
34
4.1.2
IMMUNPRAEZIPITATION
VON
PROTEINEN
.
35
4.1.3
PROTEASE-MAPPING
ANALYSE
.
35
4.2
IN
VITRO
PROZESSIERUNG
DURCH
GEREINIGTE
LEADERPEPTIDASE
.
35
4.3
KOTRANSLATIONALER
PROTEINTRANSPORT
IN
"INSIDE-OUT"
ZYTOPLASMAMEMBRANVESIKEL
.
36
4.4
SECB-PRAEKURSOR-KOIMMUNPRAEZIPITATION
.
36
4.5
SECA-PRAEKURSOR-KOIMMUNPRAEZIPITATION
.
36
4.6
QUANTIFIZIERUNG
.
36
ERGEBNISSE
38
TEIH
.
38
1.
DER
EFFEKT
VON
SECB
AUF
DIE
TRANSLOKATION
VON
M13
PROCOAT
.
38
2.
BINDUNG
VON
M13
PROCOAT
AN
SECB
.
40
3.
DER
EFFEKT
DER
SECA-ATPASE-AKTIVITAET
AUF
DIE
TRANSLOKATION
VON
M13
PROCOAT
.
44
4.
BINDUNG
VON
M13
PROCOAT
AN
SECA.
.
46
V
TEIL
2
.
49
1.
NACHWEIS
DER
PROZESSIERUNG
DER
HYBRIDPROTEINE
A80, A60,
A40,
A35
UND
A20
.
51
2.
STUDIEN
ZUR
LOKALISATION
DER
HYBRIDPROTEINE
.
54
3.
DER
EFFEKT
VON
SECB
AUF
DIE
TRANSLOKATION
DER
HYBRIDPROTEINE
PRO828COAT,
A80,
A60,
A40,
A35UNDA20
.
59
4.
DIE
ROLLE
DER
M13
PROCOAT-SIGNALSEQUENZ
BEZUEGLICH
DER
TRANSLOKATION
IN
ABHAENGIGKEIT
VON
SECB
.
61
5.
SECB-BINDUNGSSTUDIEN
.
61
6.
DIE
TRANSLOKATION
DER
HYBRIDPROTEINE
IN
ABHAENGIGKEIT
VON
DER
SECA-ATPASE-AKTIVITAET62
7.
SECA-BINDUNGSSTUDIEN
.
64
8.
DER
EFFEKT
VON
SECY
AUF
DIE
TRANSLOKATION
DER
HYBRIDPROTEINE
.
65
DISKUSSION
68
1.
ZUR
INTERAKTION
VON
M13
PROCOAT
MIT
SECB
UND
SECA
.
68
2.
DIE
ROLLE
DER
PERIPLASMATISCH
TRANSLOZIERTEN
DOMAENE
BEI
DER
DISKRIMINIERUNG
ZWISCHEN
.
SEC-ABHAENGIGER
UND
SEC-UNABHAENGIGER
TRANSLOKATION
.
70
2.1
ZUR
ROLLE
VON
SECB
WAEHREND
DER
TRANSLOKATION
DER
HYBRIDPROTEINE
.
71
2.2
ZUR
ROLLE
VON
SECA
WAEHREND
DER
TRANSLOKATION
DER
HYBRIDPROTEINE
.
73
2.3
ZUR
ROLLE
VON
SECY
WAEHREND
DER
TRANSLOKATION
DER
HYBRIDPROTEINE
.
76
3.
BETRACHTUNGEN
ZUM
MECHANISTISCHEN
ABLAUF
DER
MEMBRANINSERTION
DER
PRAEKURSOREN
PRO828COAT,
A80,
A60,
A40,
A35
UND
A20.
78
ZUSAMMENFASSUNG
81
LITERATURVERZEICHNIS
83 |
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