Funktionelle Charakterisierung eines Dopamin-Rezeptors aus Drosophila melanogaster:
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Jülich
Forschungszentrum, Zentralbibliothek
1995
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
I
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
V
1.
EINLEITUNG
1
1.1
MECHANISMEN
DER
SIGNALTRANSDUKTION
1
1.2
EIGENSCHAFTEN
G-PROTEIN-GEKOPPELTER
REZEPTOREN
2
1.3
DER
NEUROTRANSMITTER
DOPAMIN
UND
SEINE
REZEPTOREN
IM
NERVENSYSTEM
5
1.4
AUFGABENSTELLUNG
UND
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
7
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
8
2.1
MATERIAL
8
2.2
BAKTERIENSTAEMME
UND
VEKTOREN
8
2.3
DNA-GROESSENSTANDARDS
9
2.4
ANZUCHT
VON
BAKTERIEN
9
2.5
VERWENDETE
GENBIBLIOTHEKEN
9
2.6
FLIEGENSTAEMME
{DROSOPHILA
MELANOGASTER)
10
2.7
FLIEGENHALTUNG
10
2.8
SYNTHESE
UND
REINIGUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
10
2.9
QUANTIFIZIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
10
2.9.1
PHOTOMETRISCHE
BESTIMMUNG
10
2.9.2
ETHIDIUMBROMID-FLUORESZENZ
10
2.10
PRAEPARATION
VON
PLASMID-DNA
11
2.10.1
MINI-PRAEPARATION
11
2.10.2
MIDI-PRAEPARATION
11
2.10.3
MAXI-PRAEPARATION
UND
REINIGUNG
DER
DNA
UEBER
EINEN
CSCL-GRADIENTEN
12
2.11
PRAEPARATION
VON
X-PHAGEN-DNA
12
2.11.1
HERSTELLUNG
VON
MG
2+
-ZELLEN
12
2.11.2
ANZUCHT
VON
X-PHAGEN
AUF
NZY-PLATTEN
13
2.11.3
PRAEPARATION
VON
X-PHAGEN-DNA
AUS
KLEINEN
LYSATEN
13
2.12
MODIFIZIERUNG
VON
DNA
13
2.12.1
GLAETTEN
UEBERHAENGENDER
ENDEN
VON
DNA-FRAGMENTEN
13
2.12.2
PHOSPHORYLIERUNG
VON
5
'-ENDEN
VON
DNA
14
2.12.3
DEPHOSPHORYLIERUNG
14
2.13
ANALYSE
VON
DNA
14
2.13.1
RESTRIKTIONEN
14
2.13.2
SEQUENZIERUNGSREAKTION
14
2.13.3
GELELEKTROPHORESE
15
2.13.4
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
16
2.14
KLONIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
16
2.14.1
LIGATION
16
2.14.2
TRANSFORMATION
16
2.14.3
SUBKLONIERUNG
VON
CDNA
BZW.
GENOMISCHER
DNA
AUS
X-PHAGEN
17
2.15
PRAEPARATION
GENOMISCHER
DNA
AUS
HEK293-ZELLEN
UND
DROSOPHILA
MELANOGASTER
Y1
2.16
PRAEPARATION
VON
RNA
17
2.16.1
PRAEPARATION
VON
GESAMT-RNA
AUS
HEK293-ZELLEN
UND
DROSOPHILA
MELANOGASTER
2.16.2
ANREICHERUNG
VON
POLYADENYLIERTER
RNA
18
2.17
NACHWEIS
SPEZIFISCHER
NUKLEINSAEUREN
18
2.17.1
TRANSFER
VON
NUKLEINSAEUREN
18
2.17.2
MARKIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
19
2.17.3
HYBRIDISIERUNG
19
2.17.4
NACHWEIS
MARKIERTER
NUKLEINSAEUREN
21
2.18
POLYMERASE-KETTEN
REAKTION
(PCR)
21
2.19
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
21
2.20
IN
SITU
HYBRIDISIERUNG
22
2.20.1
ERSTELLEN
VON
GEWEBESCHNITTEN
AUS
DROSOPHILA-KOEPFEN
22
2.20.2
HYBRIDISIERUNG
DER
GEWEBESCHNITTE
22
2.21
ZELLKULTUR
23
2.21.1
KULTIVIERUNG
DER
ZELLEN
23
2.21.2
LAGERUNG
VON
HEK293-ZELLEN
IN
FLUESSIGEM
STICKSTOFF
23
2.21.3
TRANSIENTE
EXPRESSION
(CAPO^METHODE)
24
2.21.4
STABILE
EXPRESSION
UND
PROPAGIERUNG
EINZELNER
KLONE
IN
HEK293-ZELLEN
25
2.21.5
MEMBRANPRAEPARATION
VON
TRANSFIZIERTEN
HEK293-ZELLEN
25
2.21.6
LIGANDENBINDUNGSTESTS
AN
MEMBRANFRAKTIONEN
VON
TRANSFIZIERTEN
HEK293-ZELLEN
26
2.22
PHARMAKOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
EXPRIMIERTEN
REZEPTOREN
26
2.22.1
INKUBATION
MIT
LIGANDEN
26
2.22.2
DETEKTION
VON
CAMP
26
2.23
MESSUNG
DER
INTRAZELLULAEREN
CA
2+
-KONZENTRATION
IN
HEK293-ZELLEN
26
2.24
IMMUNZYTOCHEMISCHER
NACHWEIS
DES
HETEROLOG
EXPRIMIERTEN
REZEPTORS
28
-N
3.
ERGEBNISSE
29
3.1
SEQUENZ
UND
HYDROPHOBIZITAETSVERGLEICHE
ZWISCHEN
DMDOPL
UND
VERSCHIEDENEN
G-PROTEIN-GEKOPPELTEN
REZEPTOREN
29
3.2
ORGANISATION
DES
DMDOPL-GENS
32
3.3
ENTWICKLUNGS
UND
GEWEBESPEZIFISCHE
LOKALISIERUNG
DER
DMDOPL-MRNA
35
3.3.1
NORTHEM-BLOT-ANALYSE
35
3.3.2
IN
SITU
HYBRIDISIERUNG
AN
GEFRIERSCHNITTEN
VON
DROSOPHILA-KOEPFEN
36
3.3.3
PCR-ANALYSE
DER
"GEWEBESPEZIFISCHEN"
EXPRESSION
41
3.4
TRANSIENTE
EXPRESSION
UND
PHARMAKOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DES
DMDOPL
REZEPTORS
42
3.4.1
HERSTELLUNG
DER
KONSTRUKTE
FUER
DIE
TRANSIENTE
EXPRESSION
IN
DER
MENSCHLICHEN
NIERENZELLINIE
(HEK293)
42
3.4.2
IMMUNZYTOCHEMISCHER
NACHWEIS
DER
EXPRESSION
DES
DMDOPL-REZEPTORS
44
3.4.2.1
ANFUGEN
DES
HETEROLOGEN
C-TAG
BEREICHES
AN
DIE
DMDOPL-SEQUENZ
44
3.4.2.2
NACHWEIS
DES
DMDOPL-REZEPTORS
MIT
HILFE
DES
C-TAG-ANTIKOERPERS
44
3.4.3
PHARMAKOLOGISCHE
UND
FUNKTIONELLE
CHARAKTERISIERUNG
DES
DMDOPL
REZEPTORS
46
3.5
ERSTELLEN
EINER
STABILEN
DMDOPL-ZELLINIE
50
3.5.1
NACHWEIS
DER
INTEGRATION
DER
DMDOP
1
-DNA
IN
DAS
GENOM
DER
HEK293
ZELLEN
51
3.5.2
INDUKTION
DER
DMDOPL-TRANSKRIPTION
52
3.5.3
PHARMAKOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DES
STABIL
EXPRIMIERTEN
DMDOPL
REZEPTORS
54
3.6
GERICHTETE
MUTAGENESE
DES
DMDOPL-REZEPTORS
55
3.6.1
N-TERMINALE
DELETIONEN
55
3.6.1.1
HERSTELLUNG
DER
DELETIONSKONSTRUKTE
55
3.6.1.2
PHARMAKOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
DELETIONSMUTANTEN
57
3.6.2
AUSTAUSCH
VON
CYSTEIN-RESTEN
IN
DEN
TRANSMEMBRANALEN
REGIONEN
TMV
UND
TM
VI
59
3.6.2.1
HERSTELLUNG
DER
CYSTEIN-AUSTAUSCHE
DURCH
GERICHTETE
MUTAGENESE
60
3.6.2.2
PHARMAKOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
CYSTEINMUTANTEN
62
3.7
FUNKTIONELLE
INTERAKTION
ZWISCHEN
HETEROLOG
EXPRIMIERTEM
DMDOP
1
-REZEPTOR
UND
CNG-KANAL
64
3.7.1
KONSTRUKTION
DER
PLASMIDE
PCDNAI-OLF/PCDNAINEO-OLF
64
3.7.2
DOPAMIN-STIMULIERTE
AKTIVIERUNG
DES
OLFAKTORISCHEN
CNG-KANALS
65
-M
4.
DISKUSSION
70
4.1
PHARMAKOLOGISCHE
IDENTIFIZIERUNG
DES
DROSOPHILA-REZEPTORS
70
4.2
MUTAGENESE-STUDIEN
ZUR
BESTIMMUNG
DER
PHARMAKOLOGISCHEN
EIGENSCHAFTEN
DES
REZEPTORS
71
4.3
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
EXPRESSIONSPROFIL
DER
REZEPTOR-SPEZIFISCHEN
MRNA
74
4.4
EINBINDUNG
DES
DMDOPL-REZEPTORS
IN
EINE
SIGNALTRANSDUKTIONSKETTE
76
5.
ZUSAMMENFASSUNG
78
6.
LITERATURVERZEICHNIS
79
A.
ANHANG
89
-IV |
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