Isolierung und Charakterisierung von extrazellulären und Zellwand-Polysacchariden aus fermenterkultivierten Basidiomyceten:
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1995
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- AOL- 6
ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON EXTRAZELLULAEREN UND
ZELLWAND-POLYSACCHARIDEN AUS FERMENTERKULTIVIERTEN BASIDIOMYCETEN
DISSERTATION
ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DER MATHEMATISCH-NATURWISSENSCHAFTLICHEN
FAKULTAET DER CHRISTIAN-ALBRECHTS-UNIVERSITAET ZU KIEL
VORGELEGT VON
ASTRID BLOHME
KIEL 1995
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS SEITE
A EINLEITUNG
1 PILZE UND PILZPOLYSACCHARIDE IN DER PHARMAZIE 1.1 PILZE ALS
WIRKSTOFFQUELLEN 1
1.1.1 PILZINHALTSSTOFFE MIT ANTITUMOR-WIRKUNG 1
1.1.2 STRUKTURELLE VORAUSSETZUNGEN FUER EINEN ANTITUINORALEN EFFEKT 2
1.1.3 WIRKUNGSWEISE ANTITUMORALER POLYSACCHARIDE AM BEISPIEL DES
LENTINANS 2
1.2 PILZE ALS LIEFERANTEN TECHNOLOGISCH NUTZBARER SUBSTANZEN. 3
2 ZIELE DIESER ARBEIT 4
B ERGEBNISSE
1 AUSWAHL EINES KULTURMEDIUMS UND EINER BASIDIOMYCETEN-SPECIES 1.1
ANFORDERUNGEN AN DAS NAEHRMEDIUM UND AN DEN PILZ , 6
1.2 KULTURVERSUCHE MIT VERSCHIEDENEN BASIDIOMYCETEN IN FLUESSIGMEDIEN 6
1.2.1 KULTUR IN ERLENMEYERKOLBEN 6
1.2.1.1 WACHSTUMSVERLAUF 10
1.2.1.2 PH-WERTVERLAUF 11
1.2.2 OPTIMIERUNG VERSCHIEDENER WACHSTUMSPARAMETER IN EINER
BIOREAKTOR-KULTUR AM BEISPIEL VON GANODERMA LIPSIENSE. 12 1.2.2.1
PH-WERTVERLAUF UND-EINFLUSS 13
1.2.2.2 EINFLUSS VON BELUEFHMGSRATE UND RUEHRERGESCHWINDIGKEIT 16 1.2.2.3
VERLAUF DER TOTALZUCKERKONZENTRATION 19
1.3 DISKUSSION UND ZUSAMMENFASSUNG 20
1.3.1 SM II ALS OPTIMALES KULTURMEDIUM FUER DIE EPS-ISOLIERUNG 20 1.3.2
GANODERMA LIPSIENSE ALS GEEIGNETER PILZ FUER DIE EPS- UND
BIOMASSE-PRODUKTION 22
1.3.3 OPTIMIERTE ANZUCHT VON GANODERMA LIPSIENSE IM 5-L-BIOREAKTOR...25
2 EXTRAZELLULAERE POLYSACCHARIDE (EPS) 2.1 EINLEITUNG 31
2.2 METHODEN ZUR ISOLIERUNG DES ROH-EPS 32
IMAGE 3
II INHALTSVERZEICHNIS
2.3 ZUSAMMENSETZUNG DES ROH-EPS 34
2.3.1 PROTEINGEHALT 34
2.3.2 URONSAEUREGEHALT 35
2.3.3 HEXOSAMINGEHALT 36
2.3.4 NEUTRALE NICHT-CHITIN-POLYSACCHARIDE 38
2.4 GPC: FRAKTIONIERUNG DES EPS AUF DER GRUNDLAGE DES HYDRODYNA- MISCHEN
VOLUMENS 40
2.4.1 PRINZIP DER GPC 40
2.4.2 BESTIMMUNG DES RELATIVEN MOLEKULARGEWICHTES 41 2.4.3
EPS-FRAKTIONIERUNG NACH DEM MOLEKULARGEWICHT 45 2.4.4 EINFLUSS DER
SALZKONZENTRATION IM ELUENTEN 45
2.5 MONOSACCHARIDKOMPONENTEN IN DEN FRAKTIONEN DES EPS VON G. LIPSIENSE
49
2.6 BESTIMMUNG DER BINDUNGSPOSITIONEN 51
2.7 DISKUSSION UND ZUSAMMENFASSUNG 58
2.7.1 EPS-ISOLIERUNG UND REINHEITSPRUEFUNG 58
2.7.2 HOMOGENITAETSPRUEFUNG UND BESTIMMUNG DES RELATIVEN MOLEKULAR-
GEWICHTS 60
2.7.3 MONOSACCHARIDBAUSTEINE UND DEREN VERKNUEPFUNGSTYPEN IM EPS VON G.
LIPSIENSE 63
2.7.4 VERSUCH EINER SEQUENZANALYSE DURCH
PARTIALFRAGMENTIERUNG....,....67 2.7.5 STRUKTURVORSCHLAEGE FUER DIE
EPS-FRAKTIONEN UND VERGLEICH MIT ANDEREN BASIDIOMYCETEN-POLYSACCHARIDEN
69
3 ZELLWANDPOLYSACCHARIDE 3.1 EINFUEHRUNG 73
3.2 ZEILWANDPRAEPARATION 75
3.3 QUANTITATIVE BESTIMMUNG DER ZELLWANDKOMPONENTEN 77 3.3.1
CHITINGEHALT 77
3.3.2 URONSAEUREGEHALT 79
3.3.3 NEUTRALE NICHT-CHITIN-POLYSACCHARIDE 80
3.4 ABTRENNUNG NEUTRALER ZELLWANDPOLYSACCHARIDE VOM CHITINANTEIL 82
3.4.1 ZEIL WANDEXTRAKTION MIT KOH-LOESUNGEN VERSCHIEDENER KONZENTRATION
82
3.4.1.1 SEQUENZIELLE ZELLWANDEXTRAKTION 83
3.4.1.2 PARALLELE ZELLWANDEXTRAKTION 88
3.4.2 SEQUENZIELLE EXTRAKTION MIT HEISSEM WASSER UND 5 % IGER KOH-LOESUNG
90
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS HL_
3.5 NEUTRALZUCKER IN DEN ZELLWANDEXTRAKTEN UND IM EXTRAKTIONS- RUECKSTAND
91
3.5.1 HEISSWASSEREXTRAKT 92
3.5.2 EXTRAKT MIT 5 % IGER KOH-LOESUNG 93
3.5.3 EXTRAKTIONSRUECKSTAND 94
3.6 HOMOGENITAETSPRUEFUNG UND BESTIMMUNG DES RELATIVEN MOLEKULAR- GEWICHTS
PER GPC 94
3.7 BESTIMMUNG DER BINDUNGSTYPEN 96
3.7.1 HEISSWASSEREXTRAKT 96
3.7.2 KOH-EXTRAKT 100
3.7.2.1 METHYLIERUNGSANALYSE 100
3.7.2.2 ^C-NMR-ANALYSE 104
3.8 BEZIEHUNG ZWISCHEN CHITIN- UND GLUCANANTEIL IN DER ZELLWAND 109
3.8.1 HINWEISE AUF KOVALENTE BINDUNGEN ZWISCHEN CHITIN UND GLUCANEN -
BISHERIGE CHEMISCH-ENZYMATISCHE UNTERSUCHUNGEN 109 3.8.2 ZUSAMMENWIRKEN
VON CHITIN UND GLUCANEN IN DER ZELLWAND
VON G. LIPSIENSE .- 110
3.9 DISKUSSION UND ZUSAMMENFASSUNG 117
3.9.1 ZELLWANDISOLIERUNG UND ZELLWANDKOMPONENTEN 117 3.9.2 GESAMTBILD
DER BASIDIOMYCETENZELLWAND 121
3.9.3 ZELLWANDPOLYSACCHARIDE UND EPS IM VERGLEICH : 126
4. TESTUNG DER EPS UND DER ZELLWANDPOLYSACCHARIDE AUF IMMUNOLOGISCHE
WIRKSAMKEIT 4.1 EINFUEHRUNG 128
4.2 PRUEFUNG DER EPS VON G. LIPSIENSE IM MTT-SYSTEM 130 4.2.1 TEST MIT
UNFRAKTIONIERTEM EPS 130
4.2.2 TEST EINZELNER EPS-FRAKTIONEN 131
4.3 PRUEFUNG DER ZELLWANDPOLYSACCHARIDE VON G. LIPSIENSE IM MTT-SYSTEM
132
4.4 DISKUSSION UND ZUSAMMENFASSUNG 133
C KURZFASSUNG DER ERGEBNISSE 136
IMAGE 5
IV INHALTSVERZEICHNIS
D EXPERIMENTELLER TEIL
1 BASIDIOMYCETEN-SPECIES 142
2 CHEMIKALIEN 143
3 METHODEN 3.1 PILZKULTUR, ERNTE UND LAGERUNG 144
3.1.1 STERILISATION UND ASEPTISCHES ARBEITEN 144
3. 3.
3.
3.
3.
3.
.2 STAMMKULTUREN 145
.3 KULTUREN AUF AGARPLATTEN 145
.4 KULTUR IN ERLENMEYERKOLBEN 148
.5 KULTUR IM BIOREAKTOR 148
.6 ABERNTEN UND KONSERVIEREN DES MYCELS. 149
.7 DOKUMENTATION VON MYCELWACHSTUM UND VERAENDERUNGEN DER
WACHSTUMSPARAMETER 149
3.2 POLYSACCHARID-ISOLIERUNG 150
3.2.1 EPS-JSOLIERUNG AUS DEM KULTURMEDIUM 150
3.2.2 ZELLWANDPRAEPARATION / -ISOLIERUNG 151
3.2.3 ZELLWANDEXTRAKTION MIT ALKALI-LOESUNG 151
3.2.3.1 VORVERSUCHE: GEEIGNETE KOH-KONZENTRATION UND EFFEKTIVSTES
EXTRAKTIONSSCHEMA 151
3.2.3.2 SEQUENZIELLE EXTRAKTION MIT HEISSEM WASSER UND 5% IGER KOH-LOESUNG
152
3.3 PHOTOMETRISCHE TESTS 153
3.3.1 TOTALZUCKERGEHALT 153
3.3.1.1 ANTHRON-TEST (MORRIS 1948) 153
3.3.1.2 PHENOL-SCHWEFELSAEURE-TEST (DUBOIS ET AL. 1956) 1 53 3.3.2
URONSAEUREN: HYDROXYDIPHENYL TEST SSLUMENKRANTZ UND ASBOE-HANSEN 1973) 154
3.3.3 CHITIN BZW. HEXOSAMINE: MBTH-TEST (PLASSARD ET AL. 1982) 154 3.3.4
PROTEINE: COOMASSIE-TEST (BRADFORD 1976, SEDMAK UND GROSSBERG 1977) 156
3.4 ENZYMATISCHER TEST: CHITINASE-EINWIRKUNG AUF ISOLIERTES
ZELLWANDMATERIAL 156
IMAGE 6
INHALTSVERZEICHNIS V_
3.5 CHROMATOGRAPHISCHE UND SPEKTROSKOPISCHE VERFAHREN 157 3.5.1
QUALITATIVE UND QUANTITATIVE NEUTRALZUCKERANALYSE PER GLC (BLAKENEY ET
AL. 1983) 157
3.5.2 BESTIMMUNG DES HYDRODYNAMISCHEN VOLUMENS PER GPC 158 3.5.3
CHARAKTERISIERUNG DER BINDUNGSSTELLEN IM POLYSACCHARID PER GC-MS 160
3.5.3.1 VOLLSTAENDIGE METHYLIERUNG (HARRIS ET AL. 1984) 160 3.5.3.2
ACETOLYSE DER EPS-FRAKTION 15000 D UND METHYLIERUNG DER BRUCHSTUECKE
(MUKUMOTO UND YAMAGUCHI 1977) 163 3.5.4 L3 C-NMR-UNTERSUCHUNG DES
REDUZIERTEN KOH-EXTRAKTES AUS
DER ZELLWAND 163
3.6 TESTUNG AUF IMMUNOLOGISCHE WIRKSAMKEIT IM MTT-SYSTEM. 164
E LITERATURVERZEICHNIS 166
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