"Phage-Display-Libraries": Isolierung und funktionelle Charakterisierung von IFNGamma-Rezeptor-bindenden Peptiden
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| adam_text | *PHAGE-DISPLAY-LIBRARIES : ISOLIERUNG UND FUNKTIONEILE CHARAKTERISIERUNG
VON IFNY REZEPTOR BINDENDEN PEPTIDEN VON DER FAKULTAET GEO- UND
BIOWISSENSCHAFTEN DER UNIVERSITAET STUTTGART ZUR ERLANGUNG DER WUERDE
EINES DOKTORS DER NATURWISSENSCHAFTEN (DR. RER. NAT.) GENEHMIGTE
ABHANDLUNG. VORGELEGT VON PASCALE BECKER AUS KARLSBRUNN/SAAR
HAUPTBERICHTER: PROF. DR. K. PFIZENMAIER MITBERICHTER: PROF. DR. D. H.
WOLF UNIVERSITAET STUTTGART INSTITUT FUER IMMUNOLOGIE UND ZELLBIOLOGIE
1995 3 INHALTSVERZEICHNIS ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 7 1. ZUSAMMENFASSUNG 9
2. EINLEITUNG 11 2.1 INTERFERONE 11 2.1.1 INTERFERON A UND INTERFERON SS
(TYP I INTERFERONE) 11 2.1.2 INTERFERON Y (TYP II INTERFERON) 12 2.2
IFNY INDUZIERBARE GENE 13 2.2.1 DAS 2 -5 OLIGOADENYLAT-SYNTHETASE
SYSTEM 13 2.2.2 DIE RNA-ABHAENGIGE P1/ELF-2A PROTEIN-KINASE 13 2.2.3 DIE
MRNA S 6-16 UND 9-27 14 2.2.4 GUANYLAT BINDENDES PROTEIN (GBP) 14 2.2.5
LNDOLAMIN-2,3-DIOXYGENASE (IDO) 14 2.2.6 MHC KLASSE II GENE 15 2.2.7 DER
HOCHAFFINE REZEPTOR FUER IGG (FCYRI) 16 2.2.8 INDUZIERBARES PROTEIN 10
(IP 10) 16 2.3 INTERFERON AKTIVIERBARE TRANSKRIPTIONSFAKTOREN 16 2.3.1
DER TRANSKRIPTIONSFAKTORKOMPLEX ISGF3 17 2.3.2 IFN GAMMA ACTIVATION
FACTOR (GAF) - 17 2.3.3 TRANSKRIPTIONSFAKTORKOMPLEXE FCRFYI UND FCRFY2
18 2.4 DIE JAK-FAMILIE (JANUS-KINASEN ODER JUST ANOTHER KINASE) 18 2.5
TYP I INTERFERON REZEPTOR 20 2.6 DER IFNY REZEPTOR 20 2.7 PHYSIOLOGIE
UND PATHOPHYSIOLOGIE VON IFNY 23 2.7.1 IFNY REZEPTOR 0/0 MAEUSE 23 2.7.2
DIE KRANKHEITSFOERDERNDE WIRKUNG VON IFNY 23 2.8 FRAGESTELLUNG 24 2.8.1
ANTIGENPRAESENTIERENDE BIBLIOTHEKEN ; 25 2.9 ZIELSETZUNG 27 3. MATERIAL
UND METHODEN 28 3.1 REAGENZIEN 28 3.1.1 CHEMIKALIEN UND MATERIALIEN 28
3.1.2 ANTIKOERPER 29 3.1.3 ZYTOKINE : 29 3.1.4 HUMANER IFNY REZEPTOR 30
3.1.5 ZELLINIEN 30 3.1.6 BAKTERIENSTAEMME 30 4 INHALTSVERZEICHNIS 3.1.7
PEPTIDPRAESENTIERENDEPHAGENBIBLIOTHEKEN 31 3.1.8 FS-PHAGE 31 3.1.9
OLIGONUKLEOTIDE 31 3.1.10 KONTROLLPEPTID 32 3.2 PUFFER, MEDIEN, LOESUNGEN
32 3.2.1 PUFFER UND LOESUNGEN 32 3.2.2 NAEHRMEDIEN FUER E. COLI 35 3.3
METHODEN 36 3.3.1 STAMMHALTUNG UND ANZUCHTBEDINGUNGEN BEI . COLI. 36
3.3.1.1 STAMMHALTUNG 36 3.3.1.2 ANZUCHTBEDINGUNGEN 36 3.3.2 ANREICHERUNG
ANTIGENBINDENDER, PEPTIDPRAESENTIERENDER PHAGEN DURCH *BIOPANNING 37
3.3.3 PRAEPARATION EINZELSTRAENGIGER FD-PHAGEN-DNA 38 3.3.4 RADIOAKTIVE
SEQUENZIERUNG EINZELSTRAENGIGER DNA 38 3.3.5 AFFINITAETSSEDIMENTATION 38
3.3.5.1 KONZENTRATION VON FD-PHAGEN DURCH FAELLUNG 39 3.3.5.2 BESTIMMUNG
EINES FD-PHAGENTITERS 39 3.3.5.3 ASSOZIATION VON ANTIGEN UND
PEPTIDPRAESENTIERENDEN FD-PHAGEN 39 3.3.6 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON DNA
.-. 40 3.3.6.1 ANNEALING 40 3.3.6.2 MARKIERUNG PARTIELL DOPPELSTRAENGIGER
OLIGONUKLEOTIDE DURCH AUFFUELLEN DER 3-ZURUECKGESETZTEN ENDEN 40 3.3.6.3
MARKIERUNG EINZELSTRAENGIGER OLIGONUKLEOTIDE AM 5-ENDE 40 3.3.7
EINFUEHRUNG VON PEPTIDEN IN HL60 ZELLEN DURCH ELEKTROPORATION 41 3.3.8
ELECTROPHORETIC MOBILITY SHIFT ASSAY (EMSA) 41 3.3.8.1 STIMULATION
DERZELLINIEN 41 3.3.8.2 HERSTELLUNG VON ZELLEXTRAKTEN FUER DEN EMSA MIT
DSGRR 41 3.3.8.3 HERSTELLUNG VON KERNEXTRAKTEN FUER DEN EMSA MIT
DSVCB-OLIGONUKLEOTID 42 3.3.8.4 HERSTELLUNG VON GESAMTZELLEXTRAKTEN FUER
DEN EMSA MIT DSGRR 42 3.3.8.5 PROTEINBESTIMMUNG 42 3.3.8.6 BINDUNGSTEST
43 3.3.9 GELELEKTROPHORESE 43 3.3.9.1 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 43
3.3.9.1.1 DNA-ELUTION AUS AGAROSEGELEN 43 3.3.9.2
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE 44 3.3.9.2.1 ELEKTROTRANSFER VON
PROTEINEN AUF NITROZELLULOSE 44 3.3.9.2.2 WESTERNBLOT 45 3.3.9.3 NATIVE
POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE 45 5 INHALTSVERZEICHNIS 3.3.9.4
HARNSTOFF-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE 45 3.3.10 125 J-IFNY-BINDUNG 46
3.3.11 CPE-TEST (CYTOPHATIC EFFECT INHIBITION) 46 4. ERGEBNISSE 47 4.1
IDENTIFIZIERUNG IFNY REZEPTOR BINDENDER PEPTIDE MITHILFE VON
PEPTIDPRAESEN- TIERENDEN PHAGENBIBLIOTHEKEN 47 4.1.1 ANREICHERUNG VON
PEPTIDPRAESENTIERENDEN PHAGEN AUS EINER 20MER PEPTIDBIBLIOTHEK 47 4.1.1.1
ANREICHERUNG MIT DIREKT GEKOPPELTEM, NATUERLICHEM IFNY REZEPTOR ALS SONDE
47 4.1.1.2 ANREICHERUNG MIT INDIREKT GEKOPPELTEM, REKOMBINANTEM IFNY
REZEPTOR ALS SONDE 48 4.1.2 VERSUCHE ZUR ANREICHERUNG VON IFNY REZEPTOR
BINDENDEN PHAGEN AUS EINER HEXAPEPTIDBANK 49 4.2 SEQUENZIERUNG .-. 50
4.2.1 . SEQUENZIERUNG DER INSERTIONEN DER PHAGEN, DIE MIT DIREKT
GEKOPPELTEM, NATUERLICHEM IFNY REZEPTOR AUS EINER 20MER PEPTIDBIBLIOTHEK
ANGEREICHERT WURDEN 51 4.2.2 SEQUENZIERUNG DER INSERTIONEN DER PHAGEN,
DIE MIT INDIREKT GEKOPPELTEM, REKOMBINANTEM IFNY REZEPTOR AUS EINER
20MER PEPTIDBIBLIOTHEK ANGEREICHERT WURDEN 52 4.2.3 SEQUENZIERUNG DER
INSERTIONEN DER PHAGEN, DIE MIT DIREKT GEKOPPELTEM, NATUERLICHEM IFNY
REZEPTOR AUS EINER HEXAPEPTIDBIBLIOTHEK ANGEREICHERT WURDEN -.: 52 4.3
HOMOLOGIEVERGLEICH MIT BEREITS BEKANNTEN PROTEINEN 53 4.4 NACHWEIS DER
ASSOZIATION DES IFNY REZEPTORS AN PEPTIDPRAESENTIERENDEN PHAGEN MITHILFE
DER AFFINITAETSSEDIMENTATION 55 4.4.1 ASSOZIATION DER
PEPTIDPRAESENTIERENDEN PHAGEN MIT DEM REKOMBINANTEN IFNY REZEPTOR 56
4.4.2 ASSOZIATION DER PEPTIDPRAESENTIERENDEN PHAGEN MIT DEM NATUERLICHEN
IFNY REZEPTOR 57 4.4.3 ASSOZIATION DES PEPTIDPRAESENTIERENDEN PHAGEN 2
MIT DER EXTRAZELLULAEREN DOMAENE DES IFNY REZEPTORS 58 4.5
SIGNALTRANSDUKTION NACH IFNY STIMULUS 59 BILDUNG DER
TRANSKRIPTIONSFAKTORKOMPLEXE FCRFYI UND FCRFY2 NACH IFNY STIMULUS:
ANALYSE IM EMSA 60 4.5.1 EINFLUSS EINES ANTIPHOSPHOTYROSIN-ANTIKOERPERS
AUF DIE FORMATION DER GRR- PROTEINKOMPLEXE 61 6 INHALTSVERZEICHNIS 4.5.2
BINDUNG KONSTITUTIV VORHANDENER PROTEINE AN DIE GRR 62 4.5.3 EINFLUSS DER
REZEPTORBINDENDEN PEPTIDE AUF DIE IFNY SIGNALTRANSDUKTION 63 4.5.3.1
ELEKTROPORATION ZUR EINSCHLEUSUNG VON PEPTIDEN IN DIE ZELLINIE HL60 64
OPTIMIERUNG DER ELEKTROPORATIONSPARAMETER 64 4.5.3.2 EINFLUSS DER
ELEKTROPORATION AUF DIE BILDUNG DER TRANSKRIPTIONSFAKTORKOMPLEXE FCRFYI
UNDFCRFY2 66 4.5.3.3 EINFLUSS DER REZEPTORBINDENDEN PEPTIDE AUF DIE
AKTIVIERUNG DER TRANSKRIPTIONS- FAKTORKOMPLEXE FCRFYI UND FCRFY2 67
ANTAGONISTISCHE WIRKUNG BEI EXTRAZELLULAERER ODER INTRAZELLULAERER PEPTID-
ZUGAEBE? 67 AGONISTISCHE WIRKUNG DER PEPTIDE BEI EXTRAZELLULAERER ODER
INTRAZELLULAERER PEPTIDZUGABE? 68 KONZENTRATIONSABHAENGIGKEIT DER
PEPTIDWIRKUNG 69 4.6 EINFLUSS DER PEPTIDE AUF DIE BILDUNG DES
TRANSKRIPTIONSFAKTORKOMPLEXES NFKB..71 4.7 AUSWIRKUNGEN DER PEPTIDE AUF
DIE LIGANDENBINDEKAPAZITAET DES IFNY REZEPTORS 73 4.8 EINFLUSS DER PEPTIDE
AUF DEN DURCH IFNY VERMITTELTEN VIRUSSCHUTZ 74 5. DISKUSSION 76 5.1
ANREICHERUNG REZEPTORBINDENDER, PEPTIDPRAESENTIERENDER PHAGEN 76 5.1.1
VARIATION BEI DERANTIGENKOPPLUNG .-. 77 5.1.2 HEXAPEPTIDBIBLIOTHEK
VERSUS 20MER BIBLIOTHEK 78 5.2 HOMOLOGIEVERGLEICH 78 5.3 UNTERSUCHUNG
DER BINDUNGSSPEZIFITAET 79 5.4 BEEINFLUSSUNG DER
LIGAND-REZEPTOR-INTERAKTION 82 5.5 DIREKTE INTERAKTION ZWISCHEN P91 UND
DER GRR 82 6. LITERATURVERZEICHNIS 85 LEBENSLAUF 101 DANKSAGUNG 102
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