Entwicklung einer Sterin-Transportprotein 2- und Sterin-Transportprotein X-defizienten transgenen Maus: Erkenntnisse zu Struktur und Funktion von Scp2
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INHALTSVERZEICHNIS
1. ZUSAMMENFASSUNG 1
2. EINLEITUNG 2
2.1. DER MENSCHLICHE CHOLESTERINSTOFFWECHSEL 2
2.2. DIE STERIN-TRANSPORTPROTEINE SCP2 UND SCPX 7
2.3. DAS GENE-TARGETING-VERFAHREN 11
3. AUFGABENSTELLUNG 19
4. EXPERIMENTELLER TEIL 20
4.1. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 20
4.1.1. DURCHMUSTERUNG EINER GENOMISCHEN GENBIBLIOTHEK 20
4.1.2. ISOLIERUNG VON PHAGEN-DNA 21
4.1.3. KLONIERUNGEN - 22
4.1.4. PRAEPARATION VON PLASMID-DNA 25
4.1.5. PRAEPARATION GENOMISCHER DNA 25
4.1.6. OLIGODESOXYNUKLEOTIDE 27
4.1.7. TECHNIKEN DER POLYMERASE-KETTENREAKTION 29
4.1.8. SOUTHEM-BLOT-VERFAHREN 30
4.1.9. NORTHEM-BLOT-VERFAHREN 31
4.1.10. SEQUENZIERUNGEN 32
4.1.11. 5'-RACE-VERFAHREN 33
4.1.12. COMPUTERGESTUETZTE AUSWERTUNGEN 35
4.2. ZELLKULTUR-TECHNIKEN 35
4.2.1. ISOLIERUNG UND KULTIVIERUNG VON FIBROBLASTEN ALS BIOMATRIX 35
4.2.2. KULTUR EMBRYONALER STAMMZELLEN (ES-ZELLEN) 36
4.2.3. ELEKTROPORATION 37
4.2.4. SELEKTION REKOMBINANTER STAMMZELLEN 37
4.2.5. STAMMZELL-INJEKTION IN BLASTOZYSTEN 38
4.2.6. KARYOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNG DER STAMMZELLEN 39
4.2.7. UNTERSUCHUNG AUF MYKOPLASMEN-KONTAMINATION 40
4.3. TIEREXPERIMENTELLE ARBEITEN 40
4.3.1. HALTUNG UND ZUCHT VON MAEUSEN 40
4.3.2. ISOLIERUNG VON BLASTOZYSTEN NACH SUPEROVULATION 41
4.3.3. ERHALT SCHEINSCHWANGERER MAEUSE 42
4.3.4. REIMPLANTIERUNG VON EMBRYONEN 42
4.3.5. KAISERSCHNITT 43
4.3.6. BLUTABNAHME 43
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
_
4.4. LIPIDCHEMISCHE VERFAHREN 44
4.4.1. FPLC-AUFTRENNUNG DES BLUTSERUMS 44
4.4.2. ISOLIERUNG VON LIPIDEN AUS DER LEBER 44
4.4.3. BESTIMMUNG VON CHOLESTERIN UND TRIGLYCERIDEN IN BIOLOGISCHEN
PROBEN 44
4.5. MATERIALIEN 45
4.5.1. VERBRAUCHSMATERIALIEN UND ORGANISMEN 45
4.5.2. LOESUNGEN UND MEDIEN 46
4.5.3. GERAETE 49
5. ERGEBNISSE 50
5.1. ARBEITSVERIAUFSPLAN 50
5.2. ANALYSE DER STRUKTUR DES MAUS STERIN-TRANSPORTPROTEIN 2-GENS
(SCP2) 51
5.2.1. PHYSIKALISCHE KARTIERUNG DES GENS 51
5.2.2. PARTIELLE ISOLIERUNG DES GENS _ 54
5.2.3. DIE STRUKTUR WEITERER SCP2-HOMOLOGER KLONE 61
5.2.4. EXPRESSIONSANALYSE VON
SCP2 69
5.2.5. HOMOLOGIEN ZU STERIN-TRANSPORTPROTEIN 2-GENEN ANDERER SPEZIES 71
5.2.6. CHROMOSOMALE LOKALISIERUNG DES GENS 72
5.3. ENTWICKLUNG DER SCP2/SCPX-DEFIZIENTEN TRANSGENEN MAUS 73
5.3.1. KLONIERUNG EINES SCPX-SPEZIFISCHEN GEN-SUBSTITUTIONSVEKTORS 73
5.3.2. KLONIERUNG EINES SCP2/SCPX-SPEZIFISCHEN GEN-SUBSTITUTIONSVEKTORS
74
5.3.3. /N-VAERO-UNTERBRECHUNG VON
SCP2 77
5.3.4. ZUECHTUNG DER SCP2/SCPX-DEFIZIENTEN TRANSGENEN MAEUSE 80
5.4. INITIALE PHAENOTYPISCHE ANALYSE DER TRANSGENEN MAEUSE 84
6. DISKUSSION 88
6.1. STRUKTUR DES STERIN-T RANSPORTPROTEIN 2-GENS DER MAUS 88
6.2. ZIELGERICHTETE UNTERBRECHUNG DES SCP2/SCPX-GENS 91
6.3. /N-V/VO-FUNKTIONEN DER STERIN-TRANSPORTPROTEINE SCP2 UND SCPX 95
7. LITERATURVERZEICHNIS 101
8. ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 116 |
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