Isolierung und Charakterisierung hepatozytärer Catalase mRNA des Meerschweinchens: Herstellung einer cDNA-Bank aus Meerschweinchenleber
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1995
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INHALTSVERZEICHNIS
TITELBLATT 1
INHALTSVERZEICHNIS 4
I EINLEITUNG 8
1 PEROXISOMEN, DIE "JUENGSTE" ZELLORGANELLE 8
2 PEROXISOMEN, EINE PLEOMORPHE ZELLORGANELLE 9
3 BIOGENESE DER PEROXISOMEN UND PROTEINIMPORT 10
4 STOFFWECHSELWEGE UND LEITENZYME DER PEROXISOMEN 11
5 PATHOLOGISCH MEDIZINISCHE ASPEKTE DER PEROXISOMEN 12
6 LEITENZYM CATALASE 13
7 VORARBEITEN UND ZIEL DER ARBEIT 15
H MATERIAL 17
1 LABORGERAETE 17
2 VERBRAUCHSMATERIAL 18
3 CHEMIKALIEN 18
4 BIOLOGISCHES MATERIAL 20
4.1 TIERE 20
4.2 HEPATOZYTEN 20
4.3 BAKTERIEN 21
4.4 VEKTOREN 21
4.5 CDNA SONDEN 21
4.6 DNA STANDARDS 21
4.7 ANTIKOERPER 21
4.8 ENZYME 22
5 KITS 22
HI METHODEN 23
1 ALLGEMEINE ARBEITSTECHNIKEN 23
1.1 ELEKTROPHORESEVERFAHREN 23
1.1.1 PROTEINELEKTROPHORESE 23
1.1.1.1 SDS-PAGE 23
1.1.1.2 SDS-GRADIENTEN-PAGE 24
1.1.1.3 SDS-SPEZIAL-PAGE 24
1.1.1.4 TRICIN-SDS-PAGE 24
4
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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1.1.2 DENATURIERENDE AGAROSEGELELEKTROPHORESE MIT FORMALIN ZUR
AUFTRENNUNG
VON RNA
1.1.3 DN A-ELEKTROPHORESE-METHODEN
1.1.3.1 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
1.1.3.2 POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
1.2 BLOTTECHNIKEN
1.2.1 PROTEINE
1.2.1.1 DOT BLOT
1.2.1.2 WESTEMBLOT UND IMMUNDETEKTION
1.2.2 RNA: NORTHERN BLOT
1.2.3 DNA
1.2.3.1 DOT BLOT
1.2.3 .2 SOUTHERN BLOT
1.3 REINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON NUKLEINSAEUREN
1.3.1 PHENOL/CHLOROFORMEXTRAKTION VON NUKLEINSAEUREN
1.3.2 FAELLUNGEN VON NUKLEINSAEUREN
1.3.2.1 ETHANOLFALLUNG
1.3.2.2 ISOPROPANOLFAELLUNG
1.3.3 PHOTOMETRIE
1.3.4 ETHIDIUMBROMIDPLATTEN
1.4 ALLGEMEINES ZUM ARBEITEN MIT BAKTERIEN
1.4.1 KULTURMEDIEN
1.4.2 KOMPETENTE BAKTERIENSTAEMME
1.4.3 TRANSFORMATION VON BAKTERIEN MIT PHAGEN
1.4.4 PRAEPARATION VON PHAGEN DNA
1.4.5
TRANSFORMATION
VON BAKTERIEN MIT PLASMIDEN
1.4.6 PLASMIDPRAEPARATION
1.5 AUTORADIOGRAPHIE
2 RNA
2.1 ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA AUS MEERSCHWEINCHENLEBER UND PRIMAEREN
HEPATOZYTENKULTUREN
2.1.1 ALLGEMEINE RESTRIKTIVE MASSNAHMEN BEIM ARBEITEN MIT RNA (RNASE
FREIE
UMGEBUNG)
2.1.2 METHODEN ZUR ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA
2.1.2.1 DIE CSCL-METHODE NACH CHIRGWIN ET AL.
2.1.2.2 DIE AGPC METHODE NACH CHOMCZYNSKI ET AL.
2.2 DIE ISOLIERUNG VON MRNA AUS GESAMT-RNA
2.2.1 SAEULENAFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
2.2.2 AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE IM BATCH VERFAHREN
2.3 CHARKTERISIERUNG DER ISOLIERTEN RNA
25
26
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29
31
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48
49
50
5
2.3.1 IN VITRO TRANSLATION 50
2.3.2 IMMUNPRAEZIPTATION TRANSLATIERTER CATALASE 51
3 DNA 52
3.1 DIE CHARAKTERISIERUNG VON DNA (CDNA) 52
3.1.1 RESTRIKTIONSVERDAU 52
3 .2 RADIOAKTIVE TECHNIKEN IM UMGANG MIT DNA 52
3 .2.1 SYNTHESE RADIOAKTIVER CDNA SONDEN 52
3 .2.2 HERSTELLUNG RADIOAKTIVER DNA MW-STANDARDS 53
3 .3 DIE HERSTELLUNG VON CDNA 53
3.3.1 DIE SYNTHESE DES ERSTEN STRANGES 53
3.3.2 DIEZWEITSTRANGSYNTHESE 54
3.3.3 DAS BLUNTING DER CDNA TERMINI 55
3.3.4 LIGATION DER ECORI ADAPTER 56
3.3.5 KINASIERUNG DER ECORI ENDEN 56
3.3.6 XHOL VERDAU 57
3.3.7 REINIGUNG DER CDNA UEBER SEPHACRYLSAEULE 58
3.3.8 PRAEZIPITATION DER CDNA 58
3.4 CHARAKTERISIERUNG DER CDNA 58
3 .5 KLONIERUNG DER SYNTHETISIERTEN CDNA 59
3.5.1 LIGATION DER CDNA MIT DER VEKTOR DNA 59
3.5.2 PACKAGING DES VEKTORS 59
3 .6 CHARAKTERISIERUNG DER PRIMAEREN CDNA-BANK 60
3 .7 AMPLIFIZIEREN DER PRIMAEREN CDNA-BANK 61
3.8 BLUE WHITE SCREENING 61
3.9 SCREENING DER CDNA BANK AUF CATALASE KLONE 62
3.9.1 COLONY BLOT UND SCREENING MIT RADIOAKTIVER CDNA SONDE 63
3.9.2 COLONY BLOT UND SCREENING MIT CATALASE ANTIKOERPER 64
IVERGEBNISSE 66
1 CHARAKTERISIERUNG DER VERSCHIEDENEN RNA PRAEPARATIONEN 66
1.1 PHOTOMETRIE 66
1.2 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE UNTER DENATURIERENDEN BEDINGUNGEN 67
1.3 NORTHEMBLOTTING 68
1.4 IN VITRO TRANSLATION UND IMMUNPRAEZIPITATION 70
2 CHARAKTERISIERUNG DER DNA 71
2.1 CHARAKTERISIERUNG DER SYNTHETISIERTEN CDNA 71
2.2 CHARAKTERISIERUNG DER PRIMAEREN CDNA-BANK 71
2.3 CHARAKTERISIERUNG DER AMPLIFIZIERTEN CDNA-BANK 72
2.4 ERGEBNISSE DES SCREENING AUF CATALASE KLONE 72
6
2.5 CHARAKTERISIERUNG DER CATALASE KLONE 75
2.6 PRIMAERSCREENING AUF AOX KLONE 79
V DISKUSSION UND AUSBLICK 80
1 WISSENSCHAFTLICHE ASPEKTE 80
2 METHODISCHE ASPEKTE 81
3 ZUSAMMENFASSUNG 86
VI LITERATURVERZEICHNIS 87
VTI EIGENE PUBLIKATIONEN IM RAHMEN DIESER ARBEIT 100
VHI LEBENSLAUF 101
IX ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 101
X DANKSAGUNG - 104
7 |
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