Identifikation Sexualpheromon-kontrollierter Gene und Charakterisierung der Genprodukte aus Volvox carteri f. nagariensis:
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| Format: | Thesis Book |
| Language: | German |
| Published: |
1995
|
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
.
1
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
5
2.1.
PUFFER,
MEDIEN,
BAKTERIENSTAEMME
.
5
2.1.1.
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
5
2.1.2.
MEDIEN
.
6
2.1.3.
BAKTERIENSTAEMME
.
7
2.2.
CHEMIKALIEN
.
7
2.3.
GERAETE
.
8
2.4.
STANDARDMETHODEN
.
9
2.5.
KULTIVIERUNG
VON
VOLVOX
CARTERI
.
9
2.5.1.
STAMMKULTURHALTUNG
.
9
2.5.2.
ANZUCHT
IM
ANALYTISCHEN
MASSSTAB
.
9
2.5.3.
ANZUCHT
IM
GROSSMASSSTAB
ZUR
GEWINNUNG
VON
POLYA+-RNA
.
10
2.5.4.
ANZUCHT
FUER
UNTERSUCHUNGEN
UEBER
EINEN
LAENGEREN
ZEITRAUM
DER
ALGENENTWICKLUNG
.
10
2.5.5.
VERWENDETER
SEXUALINDUKTOR
.
10
2.6.
ISOLIERUNG
EINZELNER
ZELLTYPEN
.
11
2.6.1.
ISOLIERUNG
VON
EMBRYONEN
.
11
2.6.2.
ISOLIERUNG
VON
GONIDIEN
UND
SOMATISCHEN
ZELLEN
.
11
2.6.3.
FRAKTIONIERUNG
DER
VOLVOXSPHAEROIDE
.
11
2.7.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
12
2.7.1.
ISOLIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
12
2.7.1.1.
ISOLIERUNG
VON
GESAMT-RNA
AUS
VOLVOX
.
12
2.7.1.2.
REINIGUNG
VON
POLYA+-RNA
AN
OLIGO-DT-CELLULOSE
.
13
2.7.1.3.
ISOLIERUNG
VON
DNA
AUS
VOLVOX
.
13
2.7.1.4.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
.
14
2.7.1.5.
ISOLIERUNG
VON
PHAGEN-DNA
.
14
2.7.1.6.
GELELEKTROPHORETISCHE
REINIGUNG
VON
DNA
.
15
2.7.2.
KLONIERUNG
VON
DNA
.
15
2.7.2.1.
PRAEPARATION
VON
VEKTOREN
.
15
2.7.2.2.
AUFFULLEN
REZESSIVER
3'-TERMINI
MIT
KLENOW-POLYMERASE.
16
2.7.2.3.
KLONIERUNG
VON
PCR-FRAGMENTEN
.
16
2.7.2.4.
LIGATION
.
17
2.7.2.5.
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
.
17
2.7.3.
EXOIII
/
MUNG
BEAN-NUKLEASE
DELETION
.
17
2.7.4.
MARKIERUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
18
2.7.4.1.
POLYA+-MRNA
.
18
2.7.4.2.
DNA
.
18
2.7.5.
CDNA-BANK
UND
HANDHABUNG
VON
PHAGEN
.
19
2.7.5.1.
LIGATION
DER
CDNA
MIT
DEN
X-ARMEN
.
19
2.7.5.2.
PHAGENVERPACKUNG
UND
PRIMAERBANK
.
19
2.7.5.3.
PLATTIEREN
DER
PHAGEN
.
19
2.7.5.4.
AMPLIFIKATION
DER
CDNA-PRIMAERBANK
.
20
2.7.5.5.
ISOLIERUNG
EINZELNER
PHAGENPLAQUES
.
20
2.7.5.6.
"IN-VIVO-EXCISION"
REKOMBINANTER
PLASMIDE
.
20
2.7.6.
TRANSFER
VON
NUKLEINSAEUREN
AUF
FILTERMEMBRANE
.
20
2.7.6.I.
PHAGENABKLATSCHE
.
20
2.7.6.2.
N
SLOT-BLOT"-TRANSFER
VON
DNA
ISOLIERTER
PHAGENKLONE
.
21
2.7.6.3.
TRANSFER
VON
BAKTERIENKOLONIEN
.
21
2.7.6.4.
SOUTHERN-BLOT
.
22
2.7.6.5.
NORTHERN-BLOT
.
22
2.7.7.
HYBRIDISIERUNG
TRAEGERGEBUNDENER
NUKLEINSAEUREN
.
22
2.7.8.
PCR
.
23
2.7.8
1.
DNA
ALS
MATRIZE
.
23
2.7.8.2.
RT-PCR
.
23
2.7.9.
HERSTELLUNG
SYNTHETISCHER
OLIGONUKLEOTIDE
.
24
2.7.10.
SEQUENZIERUNG
VON
DOPPELSTRANG-DNA
.
24
2.7.10.1.
NACH
SANGER
MIT
T7-DNA-POLYMERASE
.
24
2.7.10.2.
MIT
TAQ-POLYMERASE
.
24
2.7.11.
FAERBUNG
VON
GEBLOTTETEN
RNA-STANDARDS
.
25
2.8.
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
.
25
2.8.1.
ANREICHERUNG
REKOMBINANTER
PROTEINE
AUS
E.
COLI
.
25
2.8.1.1.
INDUKTION
.
25
2.8.1.2.
AUFTRENNUNG
IN
LOESLICHE
UND
UNLOESLICHE
ZELLBESTANDTEILE
.
26
2.8.1.3.
REINIGUNG
UEBER
NICKEL-CHELAT-AGAROSE
.
26
2.8.2.
RUECKFALTUNG
DENATURIERTER
PROTEINE
.
27
2.8.3.
WESTEM-BLOTTING
.
27
2.8.4.
PROTEASE-AKTIVITAETSTESTS
.
27
2.8.4.I.
ABBAU
VON
CASEIN
IN
LOESUNG
.
27
2.8.4.2.
IN-GEL
PROTEASE
TEST
.
28
2.8.5.
IN-GEL
CHITINASE
TEST
.
28
2.8.6.
CHITIN-BINDE-VERSUCH
.
28
2
8.7
SALZEXTRAKTION
VON
J5
S-MARKIERTEM
PHEROPHORIN
II
.
29
2
9
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
.
29
2.9.1
HERSTELLUNG
POLYKLONALER
ANTIKOERPER
.
29
2
9
2
IMMUNODETEKTION
VON
WESTEM-BLOTS
.
30
2
9.3.
IMMUNOFLUORESZENZ
INTAKTER
VOLVOX-SPHAEROIDE
.
30
3.
ERGEBNISSE
.
31
3
1
VERWENDETE
CDNA-BANK
.
31
3
2
"DIFFERENTIELLES
SCREENING"
.
31
3.2
1.
VORKENNTNISSE
.
32
3
2.2.
ERGEBNISSE
DER
HYBRIDISIERUNG
.
32
3.2.3.
IDENTIFIZIERUNG
IDENTISCHER
KLONE
UND
ERSTE
CHARAKTERISIERUNG
DER
TRANSKRIPTE
.
33
3
2.3
I
3'-TERMINALES
ANSEQUENZIEREN
.
33
3.2
3
2
N
ORTHEM-BLOT
.
33
3.23.3
KREUZHYBRIDISIERUNG
.
35
3.3
KLONB12/L
.
36
3
3
1
SUCHE
NACH
VOLLAENGENKLONEN
UND
AUFKLAERUNG
DER
SEQUENZ
.
36
3.3
2.
SEQUENZANALYSEN
.
36
3.3
3
HETEROLOGE
EXPRESSION
IN
E.
COLI
.
41
3.3.4
FUNKTIONSANALYSEN
MIT
PEXB
12/1
.
42
3.3.4.1.
DIE
PROTEOLYTISCHE
AKTIVITAET
BEDARF
EINER
KOMPONENTE
DES
VOLVOXMEDIUMS
.
.
.43
3
3
4
2.
DIE
PROTEOLYTISCHE
AKTIVITAET
IST
MIT
PEXB12/L
KORRELIERT
44
3.3.4.3
ERMITTLUNG
EINES
DEFINIERTEN
PUFFERSYSTEMS
.
45
3.3.4.4
PEXB12/L
IST
EINE
CA
2+
-ABHAENGIGE
PROTEASE
.
46
3
3.4.5.
ERMITTLUNG
DER
OPTIMALEN
CA
2+
-KONZENTRATION
.
48
3.3.4.6
45
CA
2+
-
BINDEASSAY
.
49
3.3.4.7
KLASSIFIZIERUNG
VON
PEXB
12/1
MITTELS
PROTEASEINHIBITOREN
.
49
3.3.4.8.
KINETIKDESCASEINABBAUS
.
50
2.3.4.9.
KINETIK
DES
EIGENVERDAUS
.
51
3.3.4.10.
SIND
PEXB12/L
UND
CASEIN-ABBAU
UNABHAENGIGE
PROZESSE
?
.
52
3.3.4.11.
KORRELATION
VON
EIGENVERDAU
UND
AKTIVITAET
.
53
3.3.4.12.
ERMITTLUNG
VON
SPALTSTELLEN
IN
PEXB12/L
.
55
3.3.4.13.
KINETIK
DES
CASEINABBAUS
DURCH
DAS
30
KD-FRAGMENT
.
.
57
3.3.4.14.
SPALTET
PEXB12/L
PHEOPHORIN
II
?
.
57
3.3.5.
DER
ANTI-PEXB
12/1
ANTIKOERPER
.
58
3
3
5.1
EIGENSCHAFTEN
DES
ANTI-PEXB
12/1
ANTIKOERPERS
.
58
3.3
5
2
VERGLEICH
VON
PEXB12/L
MIT
DEM
PROTEIN
AUS
VOLVOX
.
,
58
3.3.6.
CHARAKTERISIERUNG
DER
BL
2/1
-EXPRESSION
.
60
3
3.6.1.
LOKALISATION
DES
BL
2/1
-TRANSKRIPTES
.
.
.
60
3.3
6.2.
LOKALISATION
DES
BL
2/1
-PROTEINS
.
60
3.36.3
KINETIK
DER
B
12/1
-EXPRESSION
BEI
VEGETATIVEN
UND
INDUZIERTEN
ALGEN
.
61
3
3.6
4
WIRD
PB12/1
WAEHREND
DER
ALGENENTWICKLUNG
PROZESSIERT
9
.
65
3.3.6.5.
TRANSKRIPTIONSSTEIGERUNG
DURCH
VERLETZUNG
DER
ALGEN
.
66
3.3
6.6.
TRANSKRIPTION
BEI
STERILEN
MUTANTEN
.
66
3
3.6.7.
VERGLEICH
DER
INDUKTION
DURCH
REKOMBINANTES
UND
VOLVOXEIGENES
PHEROMON
.
.
67
3.3.7
NACHWEIS
DER
PROTEOLYTISCHEN
AKTIVITAET
VON
PB
12/1
IN
HITZEEXTRAKTEN
AUS
VOLVOX
.
68
3.4
KLON
10/4
.
70
3
4.1.
SUCHE
NACH
VOLLAENGENKLONEN
.
70
3
4
2
ANALYSE
DES
GENOMISCHEN
KLONS
XG10/4-4
.
70
3.4.3.
SEQUENZANALYSEN
.
74
3.4.4
HETEROLOGE
EXPRESSION
IN
E.
COLI
UND
ANTIKOERPERHERSTELLUNG
.
79
3.4.5.
CHARAKTERISIERUNG
DER
10/4-EXPRESSION.
.
81
3.4.5.1.
LOKALISATION
DES
10/4-TRANSKRIPTES
.
81
3.4.5.2.
LOKALISATION
DES
10/4-PROTEINS
.
81
3.4.5.3.
KINETIK
DER
10/4-EXPRESSION
BEI
VEGETATIVEN
UND
INDUZIERTEN
ALGEN
.
84
3.4.5.4.
TRANSKRIPTIONSSTEIGERUNG
DURCH
VERLETZUNG
DER
ALGEN
.
86
3.4.5.5.
TRANSKRIPTION
BEI
STERILEN
MUTANTEN
.
86
3.4.5.6.
VERGLEICH
DER
INDUKTION
DURCH
REKOMBINANTES
UND
VOLVOXEIGENES
PHEROMON
.
87
3.4.6.
FUNKTIONSANALYSEN
MIT
PEXTRIDO
.
88
3.4.6.1.
PEXTRIDO
BINDET
AN
CHITIN
.
88
3.4.6.2.
BESITZT
PEXTRIDO
CHITINASEAKTIVITAET
?
.
91
3.4.7.
FUNKTIONSANALYSEN
MIT
P10/4
AUS
VOLVOX
.
92
3.4.7.1.
BINDET
P10/4
AN
CHITIN?
.
92
3.4.7.2.
BESITZT
P10/4
CHITINASEAKTIVITAET
?
.
94
3.5.
KLON
17/3
.
96
3.5.1.
SUCHE
NACH
VOLLAENGENKLONEN
.
96
3.5.2.
ANALYSE
DES
GENOMISCHEN
KLONS
XG17/3-3
.
96
3.5.3.
SEQUENZANALYSEN
.
99
3.5.4.
CHARAKTERISIERUNG
DER
17/3-TRANSKRIPTION
.
103
3.5.4.1.
LOKALISATION
DES
TRANSKRIPTES
.
103
3.5.4.2.
KINETIK
DER
17/3-TRANSKRIPTION
BEI
VEGETATIVEN
UND
INDUZIERTEN
ALGEN
.
104
3.5.4.3.
TRANSKRIPTIONSSTEIGERUNG
DURCH
VERLETZUNG
DER
ALGEN
.
105
3.5.4.4.
TRANSKRIPTION
BEI
STERILEN
MUTANTEN
.
105
3.5.4.5.
VERGLEICH
DER
INDUKTION
DURCH
REKOMBINANTES
UND
VOLVOXEIGENES
PHEROMON
.
106
3.6.
KLON
23/1
.
107
3.6.1.
SUCHE
NACH
VOLLAENGENKLONEN
.
107
3.6.2.
ANALYSE
DES
GENOMISCHEN
KLONS
XG23/1-1
.
107
3.6.3.
CHARAKTERISIERUNG
DER
23/1-TRANSKRIPTION
.
109
3.6.3.1.
LOKALISATION
DES
TRANSKRIPTES
.
109
3.6.3.2.
KINETIK
DER
23/1-TRANSKRIPTION
BEI
VEGETATIVEN
UND
INDUZIERTEN
ALGEN
.
110
3.6.3.3.
TRANSKRIPTIONSSTEIGERUNG
DURCH
VERLETZUNG
DER
ALGEN
.HO
3.6.3.4.
TRANSKRIPTION
BEI
STERILEN
MUTANTEN
.
111
3.6.3.5.
VERGLEICH
DER
INDUKTION
DURCH
REKOMBINANTES
UND
VOLVOXEIGENES
PHEROMON
.
112
4.
DISKUSSION
.
113
KLONB12/L
.
114
KLON
10/4
.
116
KLON
17/3.
.
117
S.
ZUSAMMENFASSUNG
.
121
6.
ANHANG
.
123
7.
LITERATURVERZEICHNIS
.
125 |
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