Klonierung und Untersuchung von ARF-Genen in Dictyostelium discoideum:
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ZUSAMMENFASSUNG
1
A.
EINLEITUNG
2
B.
ERGEBNISSE
9
1.
STRUKTUR
DER
ARF
GENE
IN
DICTYOSTELIUM
DISCOLDEUM
9
1.1.
KLONIERUNG
DER
DICTYOSTELIUM
ARF
GENE
9
1.1.1.
PCR-AMPLIFIKATION
VON
ARF
AUS
GENOMISCHER
DNA
9
1.1.2
KLONIERUNG
EINES
380BP
ARF-FRAGMENTS
10
1.1.3.
ISOLIERUNG
DER
DDARFL
CDNA
11
1.1.4.
AMPLIFIZIERUNG
DER
DDARF2
CDNA
11
1.1.5.
DDARFL
INTRONS
12
1.2.
SEQUENZIERUNGSSTRATEGIEN
14
1.2.1.
DDARFL
UND
DDARF2
14
1.2.2.
DDARF3
16
1.3.
HOMOLOGIEVERGLEICH
18
1.3.1
VERGLEICH
DER
NUKLEOTIDSEQUENZEN
18
1.3.2.
ANALYSE
DER
ABGELEITETEN
AMINOSAEURESEQUENZEN
19
1.4.
SOUTHERN
ANALYSE
DER
DICTYOSTELIUM
ARF-GENE
24
2.
UNTERSUCHUNG
DER
ARF
MRNA
EXPRESSION
27
2.1.
NORTHERN
BLOT
TESTS
27
2.2.
PCR-ANALYSE
AUF
MRNA
EXPRESSION
28
3.
ISOLATION
VON
"GENE-DLSRUPTLONS"
MUTANTEN
29
3.1.
PLASMIDKONSTRUKTION
29
3.2.
TEST
AUF
PLASMIDINTEGRATION
DURCH
PCR-SREEENING
VERFAHREN
30
3.3.
COLONY
UND
NORTHERN
BLOTS
DER
TRANSFORMANTEN
32
3.4.
SOUTHERN
BLOT
ANALYSEN
DER
TRANSFORMANTEN
33
4.
ANALYSE
DER
"
ANTISENSE"-TRANSFORMANTEN
35
4.1.
HERSTELLUNG
VON
DDARFL
-"
ANTISENSE
"
-
VEKTOREN
UND
TRANSFORMATION
35
4.2.
MRNA
EXPRESSION
DER
TRANSFORMANTEN
UND
IHRE
PHAENOTYPISCHE
CHARAKTERISIERUNG
36
5.
EXPRESSION
VON
DDARFL
IN
E.COLL
38
5.1.
HERSTELLUNG
VON
EXPRESSIONSPLASMIDEN
38
5.2.
REINIGUNG
UND
SPALTUNG
DES
FUSIONSPROTEINS
38
5.3.
IMMUNISIERUNG
39
6.
PROTEINCHARAKTERISIERUNG
40
6.1.
ENDOGENE
ADP-RIBOSYLIERUNG
DES
REKOMBINANTEN
DDARFL
PROTEINS
40
6.2.
GTP-BINDUNGVERSUCHE
MIT
REKOMBINANTEM
DDARFL
41
C.
DISKUSSION
42
1.
STELLUNG
DER
DDARF-GENE
INNERHALB
DER
ARF-FAMLLLE
UND
IHRE
42
CHARAKTERISTISCHEN
SEQUENZ-MERKMALE
1.1.
DDARFL
,
EIN
KLASSISCHER
VERTRETER
DER
ARF-FAMILIE
43
1.2.
DIE
NEUARTIGEN
SEQUENZMOTIVE
VONDDARF2
44
2.
BIOCHEMISCHE
EIGENSCHAFTEN
VON
REKOMBINANTEM
DDARFL
45
2.1.
BEDINGUNGEN
FUER
DIE
GTP-BINDUNG
45
2.2.
ADP-RIBOSYLIERUNG
MIT
REKOMBINANTEM
DDARFL
46
3.
DDARFL
"
GENE-DLSRUPTLON
"
MUTANTEN
47
4.
DDARFL
"ANTISENSE
"
-TRANSFORMATION
48
D.
MATERIAL
UND
METHODEN
49
I.
MATERIALIEN
49
1.
ABKUERZUNGEN
49
2.
BAKTERIENSTAEMME
49
II.
METHODEN
50
1.
MOLEKULARBLOLOGLSCHE
METHODEN
50
1.1.
PRAEPARATION
VON
NUKLEINSAEUREN
50
1.1.1.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
E.COLI
(BIRNBOIM
U.
DOLY,
1979)
50
1.1.2.
PRAEPARATION
VON
M1
3
DNA
(MESSING
ET
AL.
1983)
50
1.1.3.
REINIGUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
51
1.1.4.
ISOLATION
VON
GENOMISCHER
DNA
AUS
DICTYOSTELIUM
(NELLEN
ET
AL.,
1987)
51
1.1.5.
ISOLATION
VON
RNA
AUS
DICTYOSTELIUM
52
1.1.6.
HERSTELLUNG
VON
OLIGONUKLEOTIDEN
UND
VERWENDETE
OLIGONUKIEOTIDE
52
1.2.
POLYMERASEKETTENREAKTION
53
1.2.1.
AMPLIFIKATION
VON
GENOMISCHER
UND
PLASMID
DNA
53
1.2.2.
PCR-"SCREENING
"
VON
BAKTERIENKLONEN
54
1.2.3.
CDNA-SYNTHESE
54
1.2.4.
ASYMMETRISCHE
PCR-AMPLIFIKATION
55
1.3.
DNA-SEQUENZIERUNG
55
1.3.1.
SEQUENZREAKTION
MIT
DSDNA
UND
M1
3
SSDNA
(SANGER
ET
AL.1
977)
55
1.3.2.
DIREKTES
SEQUENZIEREN
VON
PCR-PRODUKTEN
56
1.3.3
SEQUENZREAKTION
MIT
TAQ-POLYMERASE
56
1.4.
SCREENING
EINER
LAMBDA
CDNA-BANK
56
1.4.1.
AUSPLATTIEREN
VON
PHAGEN
56
1.4.2.
HERSTELLUNG
VON
PLAQUELIFTS
57
1.4.3.
PLASMID-"EXCISION
"
57
1.5.
GELELEKTROPHORESE
57
1.5.1.
DNA-SEQUENZGELELEKTROPHORESE
57
1.5.2.
DNA
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
58
1.5.3.
RNA-GELELEKTROPHORESE
58
1.6.
HERSTELLUNG
REKOMBINANTER
DNA
58
1.6.1.
RESTRIKTIONSVERDAU
58
1.6.2.
PHOSPHATASE-BEHANDLUNG
58
1.6.3.
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
59
1.6.4.
KLONIERUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
59
1.7.
KOMPETENZENTWICKLUNG
UND
TRANSFORMATION
VON
E.COLI
60
4.
ANALYSE
DER
"
ANTLSENSE
"
-TRANSFORMANTEN
35
4.1.
HERSTELLUNG
VON
DDARFL-"ANTISENSE
"
-
VEKTOREN
UND
TRANSFORMATION
35
4.2.
MRNA
EXPRESSION
DER
TRANSFORMANTEN
UND
IHRE
PHAENOTYPISCHE
CHARAKTERISIERUNG
36
5.
EXPRESSION
VON
DDARFL
IN
E.COLI
38
5.1.
HERSTELLUNG
VON
EXPRESSIONSPLASMIDEN
38
5.2.
REINIGUNG
UND
SPALTUNG
DES
FUSIONSPROTEINS
38
5.3.
IMMUNISIERUNG
39
6.
PROTEINCHARAKTERISIERUNG
40
6.1.
ENDOGENE
ADP-RIBOSYLIERUNG
DES
REKOMBINANTEN
DDARFL
PROTEINS
40
6.2.
GTP-BINDUNGVERSUCHE
MIT
REKOMBINANTEM
DDARFL
41
C.
DISKUSSION
42
1.
STELLUNG
DER
DDARF-GENE
INNERHALB
DER
ARF-FAMLLLE
UND
IHRE
42
CHARAKTERISTISCHEN
SEQUENZ-MERKMALE
1.1.
DDARFL
,
EIN
KLASSISCHER
VERTRETER
DER
ARF-FAMILIE
43
1.2.
DIE
NEUARTIGEN
SEQUENZMOTIVE
VONDDARF2
44
2.
BIOCHEMISCHE
EIGENSCHAFTEN
VON
REKOMBINANTEM
DDARFL
45
2.1.
BEDINGUNGEN
FUER
DIE
GTP-BINDUNG
45
2.2.
ADP-RIBOSYLIERUNG
MIT
REKOMBINANTEM
DDARFL
46
3.
DDARFL
"GENE-DISRUPTION
"
MUTANTEN
47
4.
DDARFL
"ANTISENSE"-TRANSFORMATLON
48
D.
MATERIAL
UND
METHODEN
49
I.
MATERIALIEN
49
1.
ABKUERZUNGEN
49
2.
BAKTERIENSTAEMME
49
1.8.
MEMBRAN-TRANSFER
UND
HYBRIDISIERUNGSMETHODEN
60
1.8.1.
SOUTHERN
TRANSFER
60
1.8.2.
NORTHERN
TRANSFER
61
1.8.3.
E.COLI
KOLONIEBLOTS
61
1.8.4.
D/CFYOSFE/RUM
RNA-KOLONIEBLOTS
(MANIAK
ET
AL.,
1988)
61
1.8.5.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
61
1.8.6.
HYBRIDISIERUNG
62
1.9.
TRANSFORMATION
VON
DICTYOSTELIUM
DISCOIDEUM
(NELLEN
ET
AL.,
1984)
62
2.
ZELLBLOLOGLSCHE
METHODEN
63
2.1.
AXENISCHES
WACHSTUM
63
2.2.
WACHSTUM
UND
ENTWICKLUNG
AUF
SM-AGARPLATTEN
63
2.3.
ENTWICKLUNG
AUF
KKG-AGARPLATTEN
64
3.
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
64
3.1.
PROTEINBESTIMMUNG
64
3.2.
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(LAEMMELI,
1970)
64
3.3.
WESTEMTRANSFER
65
3.4.
GTP-BINDUNGS
ASSAY
(ROTHMAN
ET
AL.,
1991)
65
3.5.
IMMUNOBLOT
66
3.6.
EXPRESSION
UND
REINIGING
EINES
REKOMBINANTEN
PROTEINS
66
3.6.1.
EXPRESSION
BAKTERIELLER
FUSIONSPROTEINE
MIT
DEM
PMAL-SYSTEM
66
3.6.2.
AFFINITAETSREINIGUNG
VON
FUSIONSPROTEINEN
66
3.6.3
SPALTUNG
UND
ELUATION
DES
FUSIONSPROTEINS
67
3.7.
HERSTELLUNG
POLYKLONALER
ANTISEREN
67
3.7.1.
IMMUNISIERUNG
67
3.7.2.
ISOLIERUNG
VON
HUEHNER-IMMUNGLOBULINEN
AUS
DOTTER
67
(JENSENIUS
ET
AL.,
1981)
3.8.
GEWINNUNG
VON
ZELLFRAKTIONEN
68
3.9.
ADP-RIBOSYLIERUNG
MIT
CHOLERA
TOXIN
68
E.
LITERATURVERZEICHNIS
69 |
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