Grundlagen zur molekularbiologischen Untersuchung halophiler Eubakterien: Aufbau eines Insertionsmutagenese-Systems für Halomonas elongata
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INHALTSVERZEICHNIS
I. EINLEITUNG.1
II.
MATERIAL UND METHODEN
.15
1. BAKTERIENSTAEMME UND PLASMIDE.15
2. NAEHRMEDIEN.16
2.1 MEDIEN ZUR STAMMHALTUNG HALOPHILER BAKTERIEN.16
2.1.1 MEDIUM ZUR STAMMHALTUNG DER TYPENSTAEMME.16
2.1.2 MEDIUM ZUR STAMMHALTUNG VON
H. ELONGATA R11 UND
DER T RANSKONJUGANTEN. 16
2.2 KONJUGATIONS- UND SELEKTIONSMEDIEN.17
2.2.1 KONJUGATIONSMEDIUM UND SELEKTIONSMEDIUM FUER
HALOMONADACEAE.17
2.2.2 SELEKTIONSMEDIUM FUER P. HALODERTITRIFICANS.17
2.3 DURCHMUSTERUNGSMEDIEN ("SCREENING" - MEDIEN).18
2.3.1 DURCHMUSTERUNGSMEDIUM ZUR IDENTIFIZIERUNG
OSMOSENSITIVERTRANSPOSONMUTANTEN VON
H. ELONGATA.18
2.3.2 DURCHMUSTERUNGSMEDIEN ZUR IDENTIFIZIERUNG
SOLUTE-AUSSCHEIDENDER MUTANTEN ("BIOSCREENING").18
2.4 MEDIEN ZUR UEBERPRUEFUNG DER ANTIBIOTIKASENSITIVITAET VON
H. ELONGATA
.19
2.5 MEDIEN FUER DIE ANZUCHT VON
E. COLI.19
2.5.1 STAMMHALTUNG.19
2.5.2 MEDIUMFUERTRANSFORMATIONSEXPERIMENTE.19
2.5.3 MEDIUM ZUR REINHEITSKONTROLLE.19
2.6 ANTIBIOTIKA (MEDIENZUSATZ FUER DIE ANZUCHT).20
3. BAKTERIENANZUCHT, STAMMHALTUNG UND ZELLEMTE.20
3.1 STAMMHALTUNG UND REINHEITSKONTROLLEN.20
3.2 BAKTERIENANZUCHT, MESSUNG DES BAKTERIENWACHSTUMS UND
ZELLEMTE.20
3.2.1 ANZUCHT VON
E. COLI.20
3.2.2 ANZUCHT HALOPHILER BAKTERIEN.21
3.2.3 MESSUNG DES BAKTERIENWACHSTUMS.21
3.2.4 ZELLEMTE.21
4. ANTIBIOTIKA-RESISTENZBESTIMMUNGEN.22
4.1 RESISTENZBESTIMMUNG IN FLUESSIGMEDIUM.22
4.2 BESTIMMUNG DER MINIMALEN INHIBITORISCHEN KONZENTRATION (MIK)
MIT HILFE DES MICROTITERPLATTEN-TESTS.23
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
II
4.3 BESTIMMUNG DER MINIMALEN INHIBITORISCHEN KONZENTRATION (MIK)
AUF FESTMEDIUM.23
4.3.1 MIK-BESTIMMUNG AUF NB-MEDIUM (AP, NX, KM, SM).23
4.3.2 MIK-BESTIMMUNG AUF SW-MEDIUM (RF).24
4.4 BESTIMMUNG DER SPEZIFISCHEN SS-LACTAMASE-AKTIVITAET.24
5. CHROMATOGRAPHISCHE METHODEN.25
5.1 PROBENVORBEREITUNG - ZELLAUFSCHLUSS UND EXTRAKTION KOMPATIBLER
SOLUTE FUER DIE HPLC-ANALYSE (MIKROEXTRAKTION).25
5.2 HOCHLEISTUNGSFLUESSIGKEITSCHROMATOGRAPHIE (HPLC).26
5.2.1 ISOKRATISCHE HPLC.26
5.2.2 GRADIENTEN HPLC MIT9-FLUORENYLMETHYL-CHLOROFORMIAT
(FMOC)-VORSAEULENDERIVATISIERUNG.27
6. MOLEKULARGENETISCHE METHODEN.29
6.1 PUFFER, LOESUNGEN UND ENZYME.29
6.1.1 PUFFERUND LOESUNGEN FUERDNA-ISOLIERUNGEN.29
6.1.2 PUFFER UND LOESUNGEN FUER AGAROSE-GELELEKTROPHORESE.29
6.1.3 PUFFER UND LOESUNGEN FUER ECKHARDT-GEL.29
6.1.4 PUFFER UND LOESUNGEN FUER SOUTHERN-
HYBRIDISIERUNGSEXPERIMENTE.29
6.1.5 LOESUNGEN FUER TRANSFORMATIONSEXPERIMENTE.30
6.1.6 ENZYME.30
6.2 DNA-ISOLIERUNG.30
6.2.1 SARKOSYL-LYSE UND CSCI/ETBR-
DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION ZUR ISOLIERUNG
CHROMOSOMALER DNA.30
6.2.2 MINIPRAEPARATION VON GESAMT-DNA 31
6.2.3 PLASMIDISOLIERUNG.32
6.3 DNA-REINIGUNG UND BESTIMMUNG DER DNA-REINHEIT.34
6.3.1 DNA-REINIGUNG MIT GENECLEAN
YY
.34
6.3.2 BESTIMMUNG DER DNA-REINHEIT UND DNA-KONZENTRATION.35
6.4 ETHANOL-FAELLUNG VON DNA.36
6.5 RESTRIKTIONSANALYSEN, AGAROSE-GELELEKTROPHORESE UND
AUSWERTUNG VON AGAROSEGELEN.36
6.5.1 DNA-SPALTUNG MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN.36
6.5.2 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE.36
6.5.3 AUSWERTUNG VON AGAROSEGELEN.37
6.6 PLASMIDMUSTERANALYSE.38
INHALTSVERZEICHNIS
6.7 T RANSFORMATION KOMPETENTER
E. COFRZELLEN.38
6.8 DNA-TRANSFER IN HALOPHILE EUBAKTERIEN -
KONJUGATIONSEXPERIMENTE.39
6.8.1 SELEKTION SM-RESISTENTER SPONTANMUTANTEN VON
H. ELONGATA
.40
6.8.2 KONJUGATIVER PLASMIDTRANSFER.41
6.9 SOUTHERN-HYBRIDISIERUNG.43
6.9.1 SOUTHERN-TRANSFER.43
6.9.2 NICHT-RADIOAKTIVE DNA-MARKIERUNG MIT DIGOXIGENIN-
DUTP.44
6.9.3 HYBRIDISIERUNG UND IMMUNOLOGISCHER NACHWEIS DER
DNA-HYBRIDE.45
7. CHEMIKALIEN UND MATERIALIEN.46
7.1 CHEMIKALIEN FUER MIKROBIOLOGISCHE METHODEN.46
7.2 REAGENZIEN FUER DIE HOCHLEISTUNGSCHROMATOGRAPHIE.46
7.3 CHEMIKALIEN UND MATERIALIEN FUERDIE MOLEKULARBIOLOGISCHEN
UNTERSUCHUNGEN.47
III. ERGEBNISSE.48
1. SCREENING-VERFAHREN.48
1.1 DURCHMUSTERUNGSVERFAHREN ZUR IDENTIFZIERUNG SALZBEDUERFTIGER
UND OSMOSENSITIVER MUTANTEN.48
1.2 NACHWEISSYSTEM FUER KOMPATIBLE SOLUTE ("BIOSCREENING").51
1.2.1 NACHWEIS KOMPATIBLER SOLUTE DURCH DAS X-GAL-SYSTEM.51
1.2.2 NACHWEIS KOMPATIBLER SOLUTE DURCH DAS NEUTRALROT-
SYSTEM.52
2. ANTIBIOTIKASENSITIVITAET UND SELEKTION.54
2.1 WIRKUNG VON KANAMYDN BEI NIEDRIGER SALINITAET IN MINIMAL- UND
KOMPLEXMEDIEN.54
2.2 INHIBITORISCHE WIRKUNG VERSCHIEDENER ANTIBIOTIKATYPEN IN
ABHAENGIGKEIT VON DER SALINITAET.55
3. DNA-ISOLIERUNG.59
4. DN A-TRANSFER VON E.
COLI ZU H. ELONGATA - KONJUGATION MIT DEM
MODELLPLASMID RP4.60
4.1 KONJUGATIONSPARAMETER.61
4.2 SELEKTION DER RP4-TRANSKONJUGANTEN UND NACHWEIS VON RP4.62
5. AUFBAU EINES MUTAGENESEVERFAHRENS MIT HILFE TRANSPOSABLER ELEMENTE
FUER
H. ELONGATA.64
INHALTSVERZEICHNIS
IV
5.1 TRANSPOSONMUTAGENESE VON
H. ELONGATA UND VERWANDTEN
HALOPHILEN EUBAKTERIEN MITTN5.65
5.1.1 WAHL DES
E. COLI-DONOR-STAMMS.66
5.1.2 TN5VERMITTELTE STREPTOMYCIN-RESISTENZ.66
5.1.3 TRANSKONJUGATIONSFREQUENZ.67
5.1.4 PHAENOTYPISCHE UND GENOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNG DER
TN5-MUTANTEN.67
5.2 TRANSPOSONMUTAGENESE VON
H. ELONGATA R11 MIT
BAKTERIOPHAGE MU-DERIVAT MU DL 1681.71
5.2.1 PHAENOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNG DER MU DL 1681 -
TRANSKONJUGANTENVON
H. ELONGATA.72
5.2.2 ANALYSE DER MU DL 1681 -MUTAGENESE AUF DNA-EBENE.73
5.3 TRANSPOSONMUTAGENESE VON
H. ELONGATA R11 MIT TN 1732.76
5.3.1 TRANSKONJUGATIONSFREQUENZ.
76
5.3.2 ANALYSE DER TN
1732-MUTAGENESE AUF DNA-EBENE.77
5.3.3 PHAENOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNG DER TN
1732-
TRANSKONJUGANTEN VON
H. ELONGATA.80
IV. DISKUSSION.83
1 EINFLUSS DER SALINITAET UND DER MEDIENZUSAMMENSETZUNG AUF DIE
ANTIBIOTIKA-RESISTENZ HALOPHILER EUBAKTERIEN.83
2. SCREENING-VERFAHREN - IDENTIFIZIERUNG SALZSENSITIVER UND
FEHLREGULIERTER
MUTANTEN.86
2.1 BIOSCREENING.86
2.2 SALZSENSITIVE UND SALZBEDUERFTIGE TRANSPOSONMUTANTEN.87
2.2.1 SALZSENSITIVE T RANSPOSONMUTANTEN.88
2.2.2 SALZBEDUERFTIGE MU DL 1681-MUTANTE VON
H. ELONGATA.90
3. DNA-TRANSFER UND TRANSPOSONMUTAGENESE - RP4-VERMITTELTE
UEBERTRAGUNG VON PLASMIDEN UND TRANSPOSABLEN ELEMENTEN IN HALOPHILE
BAKTERIEN.90
3.1 KONJUGATIVER DNA-TRANSFER.90
3.2 INSERTION TRANSPOSABLER ELEMENTE IN
H. ELONGATA.93
3.2.1 TRANSPOSON TN5.93
3.2.2 TRANSPOSON MU DL 1681.95
3.2.3 TRANSPOSON TN
1732.99
V. ZUSAMMENFASSUNG.102
VI. LITERATUR.104 |
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