Kandidatenregion der autosomal-rezessiven proximalen spinalen Muskelatrophie (5q11.2-13.3): physikalische Kartierung und Isolierung von Transkripten
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG.1
1.1 CHARAKTERISIERUNG DER AUTOSOMAL-REZESSIVEN PROXIMALEN MUSKELATROPHIE
(SMA).1
1.1.1 KLINISCHES ERSCHEINUNGSBILD DER AUTOSOMAL-REZESSIVEN PROXIMALEN 1
MUSKELATROPHIE (SMA).1
1.1.2 DIAGNOSTISCHE KRITERIEN DER AUTOSOMAL-REZESSIVEN PROXIMALEN SMA.2
1.2 ISOLIERUNG DES SMA-GENS MIT HILFE DER POSITIONSKLONIERUNG.3
1.2.1 ALLGEMEINE GRUNDLAGEN VON KOPPLUNGSUNTERSUCHUNGEN UND
ASSOZIATIONSSTUDIEN.^.4
1.2.2 GENETISCHE KARTIERUNG DES SMA-GENS.6
1.2.3 ANREICHERUNG DER REGION MIT NEUEN MARKERN.7
1.2.4 PHYSIKALISCHE KARTIERUNG DER SMA-REGION.9
1.3 ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON CDNA-KLONEN.12
1.4 ZIELSETZUNGEN DER ARBEIT.14
2. MATERIAL .15
2.1 BAKTERIENSTAEMME.^.15
2.2 VEKTOREN.V.15
2.3 SOMAZELLHYBRIDE.15
2.4 BESTRAHLUNGSHYBRIDE.15
2.5 COSMIDE.16
2.6 ICRF-YACS.:.16
2.7 CEPH-YACS.16
2.8 CEPH-MEGA-YAC.16
2.9 CDNA-BANKEN.16
2.10 NORTHEM-BLOTS.16
2.11 LAENGENSTANDARDS.16
2.12 COMPUTER-PROGRAMME.16
3. METHODEN.17
3.1 CHARAKTERISIERUNG VON YACS (YEAST ARTIFICIAL CHROMOSOMES).17
3.1.1 ISOLIERUNG VON YACS.17
3.1.1.1 ISOLIERUNG VON YACS DURCH HYBRIDISIERUNG VON YAC-GENBANK
FILTERN.17
3.1.1.2 ISOLIERUNG VON YACS AUS YAC-DNA POOLS MIT HILFE VON PCR.18
3.1.2 ISOLIERUNG VON YAC-ENDEN ZUR DURCHFUEHRUNG DES YAC-WALKING.19
3.1.2.1 YAC-ENDEN ISOLIERUNG MIT HILFE DER PLASMID-RESCUE METHODE.20
3.1.2.2 ALU-VEKTOR PCR ZUR ISOLIERUNG VON YAC-ENDEN.20
3.1.2.3 ISOLIERUNG TERMINALER SEQUENZEN VON YACS MIT HILFE DER
VECTORETTE-
PCR METHODE.21
3.1.3 VERMEHRUNG VON YACS.24
3.1.4 ISOLIERUNG UND VERPACKUNG HOCHMOLEKULARER YAC-DNA.25
3.1.5 RESTRIKTIONSVERDAU VON YAC-BLOECKCHEN.26
3.1.6 SEPARATION VON GROSSEN DNA-FRAGMENTEN MITTELS PULSFELD-GELELEKTRO-
PORESE (PFGE).26
3.1.7 ISOLIERUNG VON YAC-DNA IN LOESUNG.28
3.2 ISOLIERUNG UND AUFBEREITUNG GENOMISCHER DNA.30
3.2.1 DNA-EXTRAKTION MITTELS DER AUSSALZMETHODE.30
3.2.2 ISOLIERUNG VON GENOMISCHER DNA AUS ZELLKULTUREN.31
3.2.3 DNA-ISOLATION AUS PLASMIDEN UND COSMIDEN.32
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/946624976
3.2.4 DNA-ISOLATION AUS PHAGEN.32
3.3 RESTRIKTIONSVERDAU VON DNA.33
3.3.1 PARTIALVEIDAU UND ENDMARKIERUNG ZUR ERSTELLUNG VON
RESTRIKTIONSKARTEN.33
3.3.1.1 PARTIALVERDAU VON COSMIDEN.33
3.4 AGAROSEGELELEKTROPHORESE UND SOUTHEM-BLOTS.34
3.4.1 FRAGMENTIERUNG, DENATURIERUNG UND NEUTRALISIERUNG DER DNA SOWIE
DURCHFUEHRUNG EINES TROCKENBLOTS.34
3.4.2 FRAGMENTIERUNG, DENATURIERUNG UND NEUTRALISIERUNG DER DNA SOWIE
DURCHFUEHRUNG EINES NASSBLOTS BEIM PFGE-BLOTTING.35
3.5 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON DNA-SONDEN.35
3.5.1 YYRANDOM-PNMED" DNA-MARKIERUNG.35
3.5.2 ENDLABELLING.36
3.5.3 ABTRENNUNG DER FREIEN NUKLEOTIDE MITTELS GELFILTRATION .37
3.5.4 ABTRENNUNG DER FREIEN NUKLEOTIDE DURCH FAELLUNG.37
3.5.5 PRAEHYBRIDISIERUNG UND HYBRIDISIERUNG.38
3.6 IDENTIFIZIERUNG VON EINZELKOPIE-SEQUENZEN (SINGLE COPIES).39
3.7 ELUTION VON DNA AUS AGAROSEGELEN.39
3.8 SUBKLONIERUNG VON DNA.40
3.9 HERSTELLUNG UND DURCHMUSTERUNG VON GENBANKEN.40
3.9.1 HERSTELLUNG EINER COSMIDBANK AUS HOCHMOLEKULARER YAC-DNA.40
3.9.2 HERSTELLUNG EINER PHAGENBANK AUS HOCHMOLEKULARER YAC-DNA.42
3.9.3 DURCHMUSTERUNG VON COSMID- UND PHAGENBANKEN ZUR SELEKTION UND
VEREINZELUNG POSITIVER KLONE.'.43
3.9.3.1 SELEKTION UND VEREINZELUNG VON COSMIDEN.43
3.9.3.2 SELEKTION UND VEREINZELUNG VON PHAGEN.44
3.9.4 AUSPLATTIERUNG, DURCHMUSTERUNG UND VEREINZELUNG VON CDNA-
GENBANKEN. 44
3.10 POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR).45
3.10.1 RADIOAKTIVE PCR.45
3.10.2 NICHT-RADIOAKTIVE PCR.46
3.11 SEQUENZIERUNG.46
3.11.1 SEQUENZIERUNG NACH SAENGER.46
3.11.2 VERMEIDUNG VORZEITIGER KETTENABBRUECHE BEI DER SEQUENZIERUNG DURCH
DIE VERWENDUNG VON DYNABEADS.47
3.11.3 AUTOMATISCHE SEQUENZIERUNG MIT DEM ABI-SEQUENZIERER.48
4. ERGEBNISSE .52
4.1 ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON YEAST ARTIFICIAL CHROMOSOMES
(YACS)DER SMA-REGION.52
4.1.1 ISOLIERUNG DREIER PROXIMAL ZU SMA LOKALISIERTER YACS YM4.1-3.52
4.1.1.1 CHARAKTERISIERUNG DER YACS YM4.1-3.53
4.1.2 ISOLIERUNG VIER WEITERER YACS YY YEFTA. 1-4 PROXIMAL ZU SMA MIT
HILFE
DER PRIMER EF(TG/AG)N.54
4.1.2.1 CHARAKTERISIERUNG DER EFTA-POSITIVEN YACS YEFTA. 1-4.55
4.1.3 CHARAKTERISIERUNG DER BEREITS ISOLIERTEN YACS YJK53.1-5 UND Y
153.56
4.1.3.1 GROESSENBESTIMMUNG DER YACS YJK53.1-5 UND YL53.56
4.1.3.2 CHARAKTERISIERUNG DER YACS YJK53.1-5 MITTELS PFGE ZUR ERSTEHUNG
VON RESTRIKTIONSKARTEN UND EINES YJK53-KONTIGS.57
4.1.3.3 ORIENTIERUNG DER YACS YJK53.1-5 UND Y 153 IM GENOM SOWIE
VERGLEICH DER GENETISCHEN UND PHYSIKALISCHEN DISTANZEN.58
4.1.3.4 CHARAKTERISIERUNG DER YAC-ENDEN VON YJK53.1, .2 UND .5 DURCH
ALU-
VEKTOR-PCR SOWIE DEREN ICARTIERU
NG GEGEN BESTRAHLUNGSHYBRIDE DER
REGION.59
4.1.3.4.1 ALU-VEKTOR-PCR SOWIE RUECKKARTIERUNG DER YAC-ENDEN VON
YJK53.1.60
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3
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2.3
ALU-VEKTOR-PCR SOWIE RUECKKARTIERUNG DER YAC-ENDEN VON YJK53.2.
ALU-VEKTOR-PCR SOWIE RUECKKARTIERUNG DER YAC-ENDEN VON YJK53.5
IDENTIFIZIERUNG UND ISOLIERUNG NEUER, UEBERLAPPENDER YAC-KLONE MIT
HILFE DES LINKEN ENDES VON YAC YJK53.1.
1. DURCHMUSTERUNG DES YAC-GENBANK DNA-POOL ZUR IDENTIFIZIERUNG
UND ISOLIERUNG NEUER, UEBERLAPPENDER YACS DURCH DIE VERWENDUNG
K53.14-SPEZIFISCHER PRIMER.
CHARAKTERISIERUNG DER JK53.14-POSITIVEN YACS Y52 E/UE UND
YLL8 G/12.
2. DURCHMUSTERUNG DER ICRF-YAC-GENBANK ZUR IDENTIFIZIERUNG UND.
ISOLIERUNG JK53.14-SPEZIFISCHER YACS.
ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON 10 CHROMOSOM 5-SPEZIFISCHEN
COSMIDEN MIT HILFE EINER 0,5KB-ECORI-EINZELKOPIESEQIIFENZ DES
PLASMID PJK53.14.
IDENTIFIZIERUNG VON CA/GTN-REPEATS IN DEN COSMIDEN C85.4C
CL78.1B, C88.10G, C60.2F UNDC34.12.
IDENTIFIZIERUNG UND ISOLIERUNG 8 NEUER YACS MITTELS EINER EINZELKOPIE-
SEQUENZ DES COSMIDS CL78.1B.
ANSEQUENZIERUNG DER 1,7KB-ECORI-EINZELKOPIESEQUENZ VON CL78.1B
SOWIE HERSTELLUNG SPEZIFISCHER PRIMER.
DURCHMUSTERUNG, IDENTIFIZIERUNG UND ISOLIERUNG 8 NEUER, 178.1B-
SPEZIFISCHER YACS YL78.1-8 UND DEREN CHARAKTERISIERUNG
ORIENTIERUNG DER YACS YL78.1-8 IM GENORII.
ISOLIERUNG VON YAC-ENDEN MITTELS ALU-VEKTOR- UND VECTORETTE-PCR
INVERTED-ALU-PCR MIT DEN YACS YJK53.1-5 UND YL78.1-8, HYBRIDI
SIERUNG DER PCR-PRODUKTE GEGEN CHROMOSOM 5-SPEZIFISCHE COSMID-
BIBLIOTHEKFILTER SOWIE IN-SITU HYBRIDISIERUNG VON COSMID-KLON^ .
CHARAKTERISIERUNG VON BESTRAHLUNGSHYBRIDEN AUS DER REGION 5QL 1.2-
13.3 MIT SMA-FLANKIERENDEN MARKERN SOWIE PHYSIKALISCHE KARTIERUNG
VON KOMPLETTEN YACS, YAC-ENDEN UND PLASMIDEN DER REGION DURCH
HYBRIDISIERUNG GEGEN BESTRAHLUNSHYBRIDFILTER.
ANREICHERUNG DER SMA-KANDIDATENREGION MIT WEITEREN KLONEN UND
ERSTELLUNG EINES COSMID-KONTIGS.
ISOLIERUNG VON STS-POSITIVEN COSMIDEN DER SMA-REGION AUS EINER
CHROMOSOM 5-SPEZIFISCHEN GENBANK UND DEREN CHARAKTERISIERUNG
RESTRIKTIONSKARTE DES STS-COSMID C24/52.
CHARAKTERISIERUNG DER YACS Y88, Y97 UND Y98.
HERSTELLUNG EINER PHAGEN-GENBANK AUS YAC Y88.
HERSTELLUNG EINER COSMID-GENBANK AUS YAC Y97.
POSITIONIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON 96
Y97-COSMIDKLONEN.
STS-LOKALISIERUNG EINZELNER Y97-COSMIDE.
HERSTELLUNG VON RESTNKTIONSKARTEN ZUR CHARAKTERISIERUNG UND ZUR
IDENTIFIZIERUNG UEBERLAPPENDER KLONE DER Y97-COSMIDBANK
IDENTIFIZIERUNG VON TRANSKRIPTEN AUS DER SMA-KANDIDATENREGION . .
AUSPLATTIERUNG VON CDNA-GENBANKEN SOWIE REPLIKAFILTERHERSTELLUNG ZUR
IDENTIFIZIERUNG VON TRANSKRIBIERTEN SEQUENZEN.
DURCHMUSTERUNG VON VERSCHIEDENEN CDNA-GENBANKEN.
IDENTIFIZIERUNG TRANSKRIBIERTER SEQUENZEN EINER MUSKEL-CDNA-BANK MIT
DEM STS-COSMID C61/23.
IDENTIFIZIERUNG UND KARTIERUNG VON TRANSKRIBIERTEN SEQUENZEN AUS EINER
MENSCHLICHEN FETALEN GEHIM-CDNA-GENBANK DURCH HYBRIDISIERUNG MIT DEN
STS-COSMIDEN C88T UND C24/52.
IDENTIFIZIERUNG UND KARTIERUNG VON WEITEREN TRANSKRIPTEN DER FETALEN
GEHIRN
CDNA-GENBANK DURCH HYBRIDISIERUNG MIT DEN YAC Y97-SPEZIFISCHEN
COSMIDEN C97/46, C97/34 UND C97/60.
.61
.62
.62
.63
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.64
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.80
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89
90
90
91
93
4.3.2A
4.3.3
4.3.4
4.3.4.1
4.3.4.2
4.3.5
4.3.5.1
4.3.5.2
4.3.5.3
4.3.6
4.3.6.1
4.3.6.2
4.3.6.3
4.3.7
4.3.7.1
4.3.7.2
4.3.7.3
4.3.7.4
IDENTIFIZIERUNG 12 WEITERE 98T-POSITIVER CDNA-KLONE MIT HILFE DER V97-
COSMIDE C97/8 UND C97/4.
CDNA-WALKING SOWIE IDENTIFIZIERUNG 6 WEITERER CDNA-KLONE DURCH
HYBRIDISIENMG FOETALER GEHIM-CDN A-GENBANKEN MIT HEM CDNA-KLON T27
SEQUENZIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON TRANSKRIPTEN AUS DER
SMA-REGION.
ANSEQUENZIERTE CDNA-KLONE.
WEITERE CHARAKTERISIERUNG DER TRANSKRIPTE T27, T83 UND T85.
CHARAKTERISIERUNG DES CDNA-KLONS T27.
VOLLSTAENDIGE SEQUENZIERUNG UND DATENANALYSE DES TRANSKRIPTS T27.
GENOMISCHE CHARAKTERISIERUNG UND LOKALISIERUNG DES T27-TRANSKRIPTS.
CHARAKTERISIERUNG VON T27 AUF MRNA-EBENE.
CHARAKTERISIERUNG DES CDNA-KLONS T83.\
VOLLSTAENDIGE SEQUENZIERUNG UND DATENANALYSE DES TRANSKRIPTS T83.
GENOMISCHE CHARAKTERSIERUNG UND LOKALISIERUNG DES TRANSKRINT; T83
CHARAKTERISIERUNG DER CDNA T83 AUF NORTHEM-BLOT EBENE. .
CHARAKTERISIERUNG DER CDNA T85.
VOLLSTAENDIGE SEQUENZ UND DATENANALYSE DES TRANSKRIPTS T85.
GENOMISCHE CHARAKTERISIERUNG UND LOKALISIERUNG DES T85-TRANSKRIPTS.
CHARAKTERISIERUNG VON T85 AUF MRNA-EBENE.
CHARAKTERISIERUNG DES T85-TRANSKRIPTS AUF DNA VON SMA-PATIENTEN. . . . .
. .
5. DISKUSSION
5.1 ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VONYEAST ARTIFICIAL CHROMOSOMES
(YACS) DER SMA-REGION.
5.2 ANREICHERUNG DER SMA-KANDIDATENREGION MIT WEITER! KLONE UND
ERSTELLUNG EINES COSMID-KONTIGS.
5.3 ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON TRANSKRIPTEN AUS DER SMA-
KANDIDATENREGION.
5.4 AKTUELLE
ERGAENZUNG.
5.4.1 KANDIDATENGENE FUER SMA.
.95
.95
.96
.97
.100
.100
.100
.102
.103
.103
.103
105
106
107
107
109
110
112
114
.114
.122
124
127
127
132
135
6. ZUSAMMENFASSUNG.
7. LITERATURVERZEI
CHNIS.
8. EIGENE VEROEFFENTLICHUNGEN
146 |
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| spelling | Piechaczek-Wappenschmidt, Barbara Verfasser aut Kandidatenregion der autosomal-rezessiven proximalen spinalen Muskelatrophie (5q11.2-13.3) physikalische Kartierung und Isolierung von Transkripten vorgelegt von Barbara Piechaczek-Wappenschmidt 1995 147 Bl. Ill. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Bonn, Univ., Diss., 1995 (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=007055842&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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