Untersuchungen zur Signalübertragung durch Protein Kinase C:
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1995
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INHALTSVERZEICHNIS
1 .EINLEITUNG
1
1.1 STRUKTUR DER PKC ISOENZYME 2
1.2. PKC AKTIVIERUNG 4
1.3. PKC DEPLETION UND HEMMUNG 6
1.4. PKC ISOENZYM EXPRESSION 8
1.5. PKC SUBSTRATE 9
1.6. PKC ISOENZYME IN DER DIFFERENZIERUNG UND TRANSFORMATION 11
2. METHODEN
14
2.1. PROTEINBESTIMMUNG 14
2.2. SDS-ELEKTROPHORESE 14
2.3. IMMUNPRAEZIPITATION 14
2.4. WESTERN BLOT 15
2.5. PKC KINASE ASSAYS 15
2.6. PHORBOL-DIBUTYRAT (PDBU) BINDUNGSSTUDIEN 16
2.7. PKC REINIGUNG 16
2.8. PHOSPHOPEPTID ANALYSEN 17
2.9. DNA-RESTRIKTIONSANALYSE 18
2.10. AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 18
2.11. POLYMERASE CHAIN REACTIONS (PCR) 18
2.12. RT-PCR 19
2.13. DIFFERENTIAL DISPLAY RT-PCR (DDRT-PCR) 19
2.14. ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 19
2.15. PHOSPHATASEBEHANDLUNG UND LIGIERUNG 20
2.16. AUFFUELLEN 5' UEBERHAENGENDER ENDEN 20
2.17. PLASMIDKLONIERUNGEN 21
2.18. RADIOAKTIVE MARKIERUNG MIT KLENOW-POLYMERASE 21
2.19. SEQUENZIERUNG VON DNA
22
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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II
2.20. KOLONIE-HYBRIDISIERUNG MIT RADIOAKTIV MARKIERTER DNA 22
2.21. SCREENEN VON CDNA BANKEN 23
2.22. SITE DIRECTED MUTAGENESIS 23
2.23. VERMEHRUNG UND AUFBEWAHRUNG VON BAKTERIEN 23
2.24. PRAEPARATIVE PLASMIDAUFARBEITUNG 24
2.25. PLASMIDE 24
2.26. ISOLIERUNG VON MRNA 25
2.27. NORTHERN-BLOT-ANALYSE 26
2.28. VERMEHRUNG VON SAEUGER-ZELLEN 27
2.29. AUFBEWAHREN VON ZELLEN 27
2.30. TRANSFEKTION VON DNA IN ZELLKULTURZELLEN 27
2.31. SELEKTION STABILER TRANSFEKTANTEN 28
2.32. KLONIEREN VON ZELLEN IM WEICHAGAR 28
2.33. IMMUNFLUORESZENZ 29
2.34. SF9 ZELLKULTUR UND BACULOVIRUS PRODUKTION 29
3. ERGEBNISSE
32
3.1. KLONIERUNG DER MAUS PKC ISOENZYME 32
3.2. PKC EXPRESSION IN HAEMOPOIETISCHEN ZELLEN 36
3.3. BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER PKC ISOENZYME 41
3.4. UEBEREXPRESSION DER PKC ISOENZYME 47
3.4.1. UEBEREXPRESSION IN 32D ZELLEN
48
3.4.2. TVROSINPHOSPHORVLIERUNA VON PKC-FT
54
3.4.3. PKC UEBEREXPRESSION IN NIH 3T3 ZELLEN
56
3.4.4.
SUBZELLULAERE LOKALISATION DER PKC ISOENZVME IN NIH 7SHAN 63
3.5. INTERAKTION DER PKC ISOENZYME MIT DER RAF-1 KINASE 69
3.5.1. PKC -RA AKTIVIERT RAF-1 DURCH DIREKTE PHOSPHORYLIERUNG
70
3.5.2.
INTERAKTION VON ANDEREN PKC ISOENZVMEN MIT RAF-1 75
3.5.3. HEMMUNG DER V-RAF TRANSFORMATION DURCH PKC-^
76
3.6. IDENTIFIZIERUNG UND KLONIERUNG VON PKC INDUZIERTEN GENEN
81
4. DISKUSSION
88
4.1. PKC ISOENZYM EXPRESSION 88
4.2. PKC UEBEREXPRESSION IN 32D 89
4.3. PKC UEBEREXPRESSION IN NIH 3T3 91
4.4. INTRAZELLULAERE LOKALISIERUNG DER PKC ISOENZYME 92
4.5. INTERAKTION VON PKC ISOENZYMEN MIT RAF-1 94
4.6. KLONIEREN DIFFERENTEXPRIMIERTER GENE 96
4.7. AUSBLICK 97
5: REFERENZEN
10O
6. DANKSAGUNG
105 |
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