Identifizierung von funktionell wichtigen Aminosäuren und Domänen in den Glucosetransportern GLUT2 und GLUT4 durch Mutanten und Chimären:
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
1.1.
DIE
FAMILIE
DER
GLUCOSETRANSPORTER
1
1
.2.
DIE
GLUCOSETRANSPORTER
GLUT2
UND
GLUT4
2
1.3.
STRUKTUR
UND
FUNKTIONSWEISE
DER
GLUCOSETRANSPORTER
3
1.4.
INHIBITOREN
DES
GLUCOSETRANSPORTS
7
1.5.
STRUKTURAUFKLAERUNG
DER
PORENBILDENDEN
REGION
DER
GLUCOSETRANSPORTER
9
1.6.
PROBLEMSTELLUNG
UND
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
11
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
2.1.
MOLEKULARBIOLOGISCHES
MATERIAL
UND
TECHNIKEN
14
2.1.1.
WIRTSSTAMM
14
2.1.2.
VEKTOREN
UND
CDNAS
14
2.13.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
GRUNDTECHNIKEN
15
2.1.4.
BAKTERIENANZUCHT
16
2.1.5.
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
17
2.1.6.
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
17
2.1.7.
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
17
2.1.8.
PRAEPARATION
VON
KLEINEN
PLASMID-DNA
MENGEN
18
2.1.9.
PRAEPARATION
VON
GROSSEN
PLASMID-DNA
MENGEN
18
2.1.10.
MUTAGENESE
18
2.1.11.
SEQUENZIERUNG
20
2.1
11.1.
SEQUENZREAKTIONEN
UND-GEL
20
2.1.11.2.
SEQUENZIERUNGSPRIMER
20
2.1.12.
UMCLONIERUNG
DER
CDNAS
IN
DEN
EXPRESSIONSVEKTOR
PCMV
21
2.2.
ZELLEN
UND
ZELLKULTUR
22
2.2
1.
ZELLEN
22
2.2.2.
MEDIEN
UND
STAMMLOESUNGEN
22
2.2.3.
ALLGEMEINE
KULTURBEDINGUNGEN
23
2.2.4.
SUBKULTIVIERUNG
23
2.2.5.
KRYOKONSERVIERUNG
23
2.2.6.
TRANSFEKTION
24
2.2.6.1.
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
VON
C0S-7-ZELLEN
MITTELS
CALCIUM
24
PHOSPHAT
PRAEZIPITATION
NACH
GRAHAM
UND
VAN
DER
EB
(1973)
2.2.6.2.
STABILE
TRANSFEKTION
DER
LM(TK
'
)-ZELLEN
MITTELS
CALCIUM
25
PHOSPHAT
PRAEZIPITATION
NACH
GRAHAM
UND
VAN
DER
EB
(1973)
2.3.
ISOLATION
VON
PLASMAMEMBRANEN,
'LOW-DENSITY'
MIKROSOMEN
UND
'HIGH-DENSITY'
25
MIKROSOMEN
AUS
TRANSFIZIERTEN
ZELLEN
2.3.1.
PRAEPARATION
UND
HOMOGENISATION
DER
ZELLEN
25
2.3.2.
FRAKTIONIERUNG
DER
ZELLHOMOGENATE
26
2.3.3.
BESTIMMUNG
DER
MEMBRANPROTEINGEHALTE
26
2.4.
REKONSTITUTION
DER
GLUCOSETRANSPORTAKTIVITAET
NACH
ROBINSON
ET
AL.
(1982)
27
2.4.1,
HERSTELLUNG
DER
LECITHIN-LIPOSOMEN
27
2.4.2.
SOLUBILISATION
UND
REKONSTITUTION
VON
GLUCOSETRANSPORTEM
IN
LECITHIN
27
LIPOSOMEN
2.4.3.
BESTIMMUNG
DER
D-GLUCOSEAUFNAHME
IN
REKONSTITUIERTE
MEMBRAN
28
VESIKEL
2.5.
NACHWEIS
DER
WILDTYP-GLUCOSETRANSPORTER,
MUTANTEN
UND
CHIMAEREN
IN
29
MEMBRANEN
TRANSFIZIERTER
ZELLEN
2.5.1.
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
29
2.5
2.
'WESTERN-BLOT'
30
2.5.3.
IMMUNOASSAY
DER
'WESTEM-BLOTS'
MIT
[
125
I]PROTEIN-A
31
2.5.4.
AUFREINIGUNG
DES
ANTISERUMS
NT4
32
2.6.
BINDUNG
INHIBITORISCHER
LIGANDEN
AN
DIE
GLUCOSETRANSPORTER
33
2.6.1.
PHOTOAFFINITAETSMARKIERUNG
DER
GLUCOSETRANSPORTER
MIT
L
125
I]IAPS
33
FORSKOLIN
2.6.2.
BINDUNG
VON
[
3
H]CYTOCHALASIN-B
AN
DIE
GLUCOSETRANSPORTER
35
3.
ERGEBNISSE
3.1.
KORRELATION
ZWISCHEN
STEIGENDER
EXPRESSION
DES
GLUT4
AUS
RATTE
IN
COS-7
37
ZELLEN
UND
DER
REKONSTITUIERTEN
GLUCOSETRANSPORTAKTIVITAET
3.2.
UNTERSUCHUNGEN
DER
MUTANTEN
Y28F,
Y143F,
Y292F,
Y293F,
Y308F,
Y432F
38
SOWIE
H337Q,
S294A
UND
RR333/334LA
DES
GLUCOSETRANSPORTERS
GLUT4
AUS
RATTE
IN
TRANSIENT
TRANSFIZIERTEN
COS-7-ZELLEN
3
2
1.
EXPRESSION
UND
SUBZELLULAERE
VERTEILUNG
DER
TRANSPORTER
IN
TRANS
40
FIZIERTEN
COS-7-ZELLEN
3.2
2.
VERGLEICH
DER
REKONSTITUIERTEN
GLUCOSETRANSPORTAKTIVITAET
IN
PLASMA
41
MEMBRANEN
VON
TRANSFIZIERTEN
C0S-7-ZELLEN
3.2.3.
BINDUNG
DES
PHOTOLABELS
[
125
I]IAPS-FORSKOLIN
AN
PLASMAMEMBRANEN
43
VON
TRANSFIZIERTEN
COS-7-ZELLEN
3.2.4.
BINDUNG
DER
INHIBITORISCHEN
LIGANDEN
[
3
H]CYTOCHALASIN-B
UND
46
FORSKOLIN
AN
PLASMAMEMBRANEN
VON
TRANSFIZIERTEN
COS-7-ZELLEN
3.2
4.1.
BINDUNG
VON
[
3
H]CYTOCHALASIN-B
AN
PLASMAMEMBRANEN
46
3.2.4.2.
VERDRAENGUNG
VON
[
3
H]CYTOCHALASIN-B
DURCH
FORSKOLIN
48
3.3.
UNTERSUCHUNGEN
DER
MUTANTEN
Y143F,
Y292F
UND
RR333/334LA
DES
GLUCOSE
50
TRANSPORTERS
GLUT4
AUS
RATTE
IN
STABIL
TRANSFIZIERTEN
LM(TK')-ZELLEN
3.3.1.
EXPRESSION
UND
SUBZELLULAERE
VERTEILUNG
DER
GLUCOSETRANSPORTER
IN
50
TRANSFIZIERTEN
LM(TK")-ZELLEN
3.3.2
VERGLEICH
DER
REKONSTITUIERTEN
GLUCOSETRANSPORTAKTIVITAET
IN
PLASMA
51
MEMBRANEN
VON
TRANSFIZIERTEN
LM(TK
'
)-ZELLEN
3.3.3.
BINDUNG
DES
PHOTOLABELS
[
125
I]IAPS-FORSKOLIN
AN
PLASMAMEMBRANEN
52
VON
TRANSFIZIERTEN
LM(TK')-ZELLEN
3.4.
UNTERSUCHUNGEN
DER
GLUT2/GLUT4-CHIMAEREN
IN
TRANSFIZIERTEN
COS-7-ZELLEN
54
3.4.1.
EXPRESSION
UND
SUBZELLULAERE
VERTEILUNG
DER
CHIMAEREN
IN
TRANSFIZIERTEN
55
COS-7-ZELLEN
3.4.2.
VERGLEICH
DER
REKONSTITUIERTEN
GLUCOSETRANSPORTAKTIVITAET
IN
PLASMA
56
MEMBRANEN
VON
TRANSFIZIERTEN
COS-7-ZELLEN
3.4.3.
BINDUNG
DES
PHOTOLABELS
[
125
I]IAPS-FORSKOLIN
AN
PLASMAMEMBRANEN
58
VON
TRANSFIZIERTEN
COS-7-ZELLEN
3.4.4.
BINDUNG
VON
[
3
H]CYTOCHALASIN-B
AN
PLASMAMEMBRANEN
VON
TRANS
62
FIXIERTEN
COS-7-ZELLEN
4.
DISKUSSION
4.1.
GUELTIGKEIT
DER
REKONSTITUIERTEN
GLUCOSETRANSPORTMESSUNG
64
4.2.
WELCHE
HELIKALEN
TYROSINE
DES
GLUT4
SPIELEN
FUER
DEN
GLUCOSETRANSPORT
EINE
65
ROLLE?
4.3.
SIND
DIE
HELIKALEN
TYROSINRESTE
AN
DER
LIGANDENBINDUNG
VON
[
3
H]CYTOCHALASIN-B,
66
FORSKOLIN
UND
[
125
I]IAPS-FORSKOLIN
BETEILIGT?
4.3.1
BINDUNG
DER
LIGANDEN
[
3
H]CYTOCHALASIN-B
UND
FORSKOLIN
66
4.3.2.BINDUNG
DES
LIGANDEN
[
125
I]IAPS-FORSKOLIN
68
4.4.
DIE
ARGININRESTE
R
333
UND
R
334
DES
GLUT4
SIND
FUER
DEN
TRANSPORT
DER
GLUCOSE
69
ESSENTIELL
4.5
DURCH
DEN
VERLUST
DER
HYDROXYLGRUPPE
DES
SERINS
S
294
IM
GLUT4
IST
SOWOHL
DIE
72
REKONSTITUIERTE
GLUCOSETRANSPORTAKTIVITAET
ALS
AUCH
DIE
BINDUNG
VON
[
125
I]IAPS
FORSKOLIN
STARK
REDUZIERT
4.6.
IM
GLUT4
IST
DIE
AMINOSAEURE
H
337
AM
GLUCOSETRANSPORT
UND
AN
DER
[
125
I]IAPS
72
FORSKOLIN-BINDUNG
NICHT
BETEILIGT
4.7
WELCHE
AMINOSAEUREN
SIND
FUER
DEN
GLUCOSETRANSPORT
UND
DIE
BINDUNG
VON
73
LIGANDEN
ESSENTIELL?
4.8.
DER
AUSTAUSCH
DER
HELIX
1
UND
DER
ERSTEN
EXTRAZELLULAEREN
SCHLEIFE
IM
GLUT2
76
UND
GLUT4
INAKTIVIERT
DEN
GLUCOSETRANSPORT
UND
DIE
[
125
I]IAPS-FORSKOLIN
BINDUNG
4.9.
WELCHE
REGIONEN
IM
GLUT2
SIND
FUER
DIR
GERINGE
AFFINITAET
GEGENUEBER
GLUCOSE,
77
[
125
I]IAPS-FORSKOLIN
UND
[
3
H]CYTOCHALASIN-B
VERANTWORTLICH?
4.9.1.
TRANSPORT
VON
GLUCOSE
77
4.9.2.
BINDUNG
DES
LIGANDEN
[
125
I]IAPS-FORSKOLIN
78
4.9.3.
BINDUNG
DES
LIGANDEN
[
3
H]CYTOCHALASIN-B
78
5.
ZUSAMMENFASSUNG
80
6.
LITERATURVERZEICHNIS
82 |
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| spelling | Wandel, Sonja Verfasser aut Identifizierung von funktionell wichtigen Aminosäuren und Domänen in den Glucosetransportern GLUT2 und GLUT4 durch Mutanten und Chimären vorgelegt von Sonja Wandel 1995 91 S. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 1995 Carrier-Proteine (DE-588)4213127-3 gnd rswk-swf Eukaryoten (DE-588)4070991-7 gnd rswk-swf Essenzielle Aminosäuren (DE-588)4311402-7 gnd rswk-swf Glucose (DE-588)4157675-5 gnd rswk-swf Zelle (DE-588)4067537-3 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Eukaryoten (DE-588)4070991-7 s Zelle (DE-588)4067537-3 s Glucose (DE-588)4157675-5 s Carrier-Proteine (DE-588)4213127-3 s Essenzielle Aminosäuren (DE-588)4311402-7 s DE-604 DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=006993640&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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