Untersuchungen zur Expression des humanen MDR1-Gens in peripheren Blutzellen und Leukämien:
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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1995
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INHALTSVERZEICHNIS
5
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
10
1.
ZUSAMMENFASSUNG
12
2.
EINLEITUNG
13
2.1
KREBS
IST
DIE
ZWEITHAEUFIGSTE
TODESURSACHE
13
2.2
MULTIDRUG-RESISTENZ
(MDR)
VON
TUMORZELLEN
13
2.2.1
MECHANISMEN
DER
ZYTOSTATIKARESISTENZ
14
2.2.2
P-GLYKOPROTEIN
ALS
URSACHE
FUER
DIE
ZYTOSTATIKARESISTENZ
15
2.2.2.1
DASAFFIWL-GEN
16
2.2.2.2
INDUKTION
DES
MDR\
-GENS
17
2.2.2.3
STRUKTUR
DES
P-GLYKOPROTEINS
17
2.2.2.4
VORKOMMEN
VON
A/DAE-GENEN
19
2.2.2.5
MECHANISMUS
DES
SUBSTRATTRANSPORTS
DURCH
P-GLYKOPROTEIN
19
2.2.2.6
HEMMUNG
DER
PUMPFUNKTION
DES
P-GLYKOPROTEINS
20
2
2.2.7
DIAGNOSTISCHE
TESTS
FUER
DIE
MDRL-GEN/
P-GLYKOPROTEIN-EXPRESSION
20
2.2.2.7
1
QUANTITATIVE
RT-PCR
ZUR
DETEKTION
DER
MDR\
-EXPRESSION
22
2.3
HAEMATOPOESE
23
2.4
LEUKAEMIE
24
2.5
ZIELE
DIESER
ARBEIT
26
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
27
3.1
BAKTERIENSTAEMME,
PLASMIDE
UND
ZELLINIEN
27
3.2
CHEMIKALIEN,
ENZYME
UND
ANDERE
MATERIALIEN
28
3.3
MEDIEN,
PUFFER
UND
LOESUNGEN
30
3.3.1
MEDIEN
30
3.3.2
PUFFER
UND
LOESUNGEN
31
3.4
BAKTERIEN
UND
ZELLKULTUR
35
3.4.1
E.-CO/I-STAMMHALTUNG
35
3.4.2
E.-CO/Z-ANZUCHTBEDINGUNGEN
35
3
4.3
LAGERUNG
DER
HUMANEN
KULTURZELLEN
35
3.4.4
ZELLKULTUR
35
3.5
MOLEKULARGENETISCHE
METHODEN
36
3.5.1
ETHANOLFIILLUNG
VON
NUCLEINSAEURE
36
3.5.2
ISOPROPANOLFAELLUNG
VON
NUCLEINSAEURE
36
3.5.3
PLASMIDISOLIERUNG
MIT
QIAGEN-ANIONENAUSTAUSCHER-SAEULEN
36
3.5.4
MASSNAHMEN
ZUR
VERMEIDUNG
VON
RNASE-KONTAMINATIONEN
37
3.5.5
GESAMT-RNA-ISOLIERUNG
MIT
QIAGEN-ANIONENAUSTAUSCHER-SAEULEN
38
3.5.6
GELELEKTROPHORESE
39
3.5
6
1
DNA-AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
39
3.5.62
RNA-AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
39
3.5
7
ELEKTROELUTION
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEBLOECKCHEN
IN
DIALYSESCHLAEUCHE
UND
REINIGUNG
DER
ISOLIERTEN
FRAGMENTE
39
3.5.8
ENZYMATISCHE
BEHANDLUNG
VON
DNA
40
3.5.8
1
SPALTUNG
MIT
RESTRIKTIONSENDONUCLEASEN
40
3.5
8.2
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
ALKALISCHER
PHOSPHATASE
41
3.5.8
3
VERBINDUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
MIT
T4-DNA-LIGASE
41
3.5.9
TRANSFORMATION
VON
PLASMID-DNA
41
3.5.10
IN-VITRO-1
RANSKRIPTION
41
3.5.11
REVERSE
TRANSKRIPTION
(RT,
CDNA-SYNTHESE)
MIT
DEM
SUPERSCRIPT
PREAMPLIFICATION
SYSTEM
42
3.5.12
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(POLYMERASE
CHAIN
REACTION,
PCR)
42
3.5.12.1
PRINZIP
42
3.5.12.2
PCR-PROTOKOLL
45
3.
S.
12.3
PRIMERSEQUENZEN
46
3.6
ISOLIERUNG
VON
LYMPHOZYTEN
AUS
DEM
HUMANEN
PERIPHEREN
BLUT
46
3.6.1
HERSTELLUNG
UND
VERWENDUNG
VON
BAUMWOLLSAEULEN
46
3.6.2
ANREICHERUNG
VON
B-UND
T-ZELLEN
UEBER
NYLONWOLLSAEULEN
46
3.6.3
PRINZIP
DES
HIGH-GRADIENT-MAGNETIC-CELL-SORTING
MIT
DEM
A//LCS-CELL-SORTING-SYSTEM
47
3.6.4
ISOLIERUNG
VON
HELFER-T-ZELLEN
(CD4
+
)
49
3.6.5
ISOLIERUNG
VON
ZYTOTOXISCHEN
T-ZELLEN
(CD8
+
)
50
3.6.6
ISOLIERUNG
VON
MONOZYTEN
(CD
14
+
)
50
3.6.7
ISOLIERUNG
VON
GRANULOZYTEN
(CD15
+
)
50
3.6.8
ISOLIERUNG
VON
B-ZELLEN
(CD
19
+
)
51
3.6.9
ISOLIERUNG
VON
NK-ZELLEN
(CD56
+
)
51
3.7
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
(FLOWCYTOMETRIE)
52
3
7.1
PRINZIP
52
3.7.2
DURCHFLUSSZYTOMETRIEANALYSE
MIT
DEM
MAK
ANTI-HUMAN-P-GLYKOPROTEIN,
MRK16
53
3.7.3
RHODAMIN-TEST
53
3.7.4
BESTIMMUNG
DER
INTRAZELLULAEREN
RHL23-FLUORESZENZZUNAHME
IN
GEGENWART
VON
R-VERAPAMIL
54
4.
ERGEBNISSE
55
4.1
ENTWICKLUNG
DES
KOMPETITIVEN
NESTED
PCR-TESTS
ZUR
QUANTIFIZIERUNG
VON
MDR
1
-MRNA
5
5
4.1.1
PRINZIP
55
4.1.2
PGEM
MDR\
487
ALS
INTERNER
STANDARD
55
4.1.3
KONSTRUKTION
VON
PGEM
AFDAEL
580
56
4.1.4
NESTED
PCR
61
4.1.5
VALIDIERUNGSEXPERIMENTE
63
4.1.5.1
ERMITTLUNG
DES
LINEAREN
BEREICHS
DER
PCR
63
4.1.5.2
VERGLEICH
DER
AMPLIFIKATIONSEFFIZIENZEN
VON
PGEM
MDR\
487,
PGEM
MDR\
580
UND
ZELLULAEREM
MDR\
-TARGET
64
4.1.5.3
TITRATION
VON
PGEM
MDR\
580
GEGEN
PGEM
MDR\
487
66
4.1.5.4
VALIDIERUNG
DER
KOMPETITIVEN
PCR
ANHAND
VON
VERDUENNUNGSREIHEN
69
4.1.6
FEINTITRATION
70
4.2
UNTERSUCHUNG
DER
MDR
1
-EXPRESSION
IN
HUMANEN
ZELLEN
71
4.2.1
UNTERSUCHUNG
DER
MDR)
-EXPRESSION
IN
ZELLINIEN
71
4.2.1.1
ERMITTLUNG
DER
ARBEITSKONZENTRATION
DES
MAK
MRK
16
72
4.2.1.2
ERMITTLUNG
DER
ANZAHL
MDAEL-MRNA-MOLEKUELE
73
4.2.1.3
BESTIMMUNG
DER
RELATIVEN
MRK16-SPEZIFISCHEN
FLUORESZENZ
73
4.2.1.4
BESTIMMUNG
DES
RH
123-EFFLUX
73
4.2.1.5
INHIBITION
DES
P-GLYKOPROTEINS
MIT
R-VERAPAMIL
74
4.2.1.6
KORRELATION
VON
MRNA-GEHALT,
MRK16-SPEZIFISCHER
FLUORESZENZ,
EFFLUX
UND
MODULIERBARKEIT
76
4.2.2
ZELLSORTIERUNG
MIT
"HIGH
GRADIENT
MAGNETIC
CELL
SEPARATION
(MACS)"
80
4.2.3
UNTERSUCHUNG
DER
EXPRESSION
DES
MDR)
-GENS
IN
ZELLULAEREN
SUBPOPULATIONEN
DES
NORMALEN
MENSCHLICHEN
BLUTS
84
4.2.3
1
ERMITTLUNG
DER
ANZAHL
AAEM?L-MRNA-MOLEKUELE
84
4
2.3.2
ERMITTLUNG
DER
RELATIVEN
MRK
16-SPEZIFISCHEN
FLUORESZENZ
89
4
2.3.3
KORRELATION
VON
MRNA-UND
MRK
16-SPEZIFISCHER
FLUORESZENZ
95
4.2.4
KONTAMINATIONSVERSUCHE
96
4.2
5
UNTERSUCHUNG
VON
PATIENTEN
MIT
AKUTER
MYELOISCHER
LEUKAEMIE
(AML)
99
4.2.5.1
ERMITTLUNG
DER
ANZAHL
MDRL-MRNA-MOLEKUELE
99
4
2.5.2
ISOLIERUNG
VON
CD33
+
-LEUKAEMIEZELLEN
ZUR
DURCHFUEHRUNG
DER
KOMPETITIVEN
PCR
99
4.2.5
3
BESTIMMUNG
DER
RELATIVEN
MRK
16-SPEZIFISCHEN
FLUORESZENZ
100
4.2.5
4
BESTIMMUNG
DES
RH-123-EFFLUX
101
4.2.5.5
MODULATIONSVERSUCHE
MIT
R-VERAPAMIL
101
4
2.5.6
KORRELATION
VON
MDR)
-MRNA-GEHALT,
MRK
16-SPEZIFISCHER
FLUORESZENZ,
EFFLUX
UND
MODULIERBARKEIT
101
5.
DISKUSSION
107
5.1
ENTWICKLUNG
DES
KOMPETITIVEN
NESTED
PCR-TESTS
107
5.1
1
KONSTRUKTION
VON
PGEMMD7?L
580
107
5.1.2
NESTED
PCR
107
5.1.3
DIE
VALIDIERUNGSEXPERIMENTE
108
5.1.4
MOEGLICHE
FEHLERQUELLEN
UND
METHODEN
ZUR
QUANTIFIZIERUNG
DER
PCR-PRODUKTE
108
5.2
UNTERSUCHUNG
DER
MDRI
-EXPRESSION
IN
HUMANEN
ZELLEN
109
5.2.1
UNTERSUCHUNG
DER
MDR}
-EXPRESSION
IN
ZELLINIEN
110
5.2.2
UNTERSUCHUNG
DER
EXPRESSION
DES
MDR}
-GENS
IN
SUBPOPULATIONEN
DES
NORMALEN
MENSCHLICHEN
BLUTS.
VERGLEICH
MIT
ANDEREN
ARBEITEN
111
5.2.3
UNTERSUCHUNG
VON
PATIENTEN
MIT
AKUTER
MYELOISCHER
LEUKAEMIE
(AML)
115
5.3
ABSCHLIESSENDE
BEMERKUNGEN
UND
AUSBLICK
117
6.
LITERATURVERZEICHNIS
121
LEBENSLAUF
133 |
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