Untersuchungen zum Oligosaccharid-Processing von N-Glycoproteinen: Reinigung und Charakterisierung der endo-Mannosidase
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1995
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG UND PROBLEMSTELLUNG 1
2 ERGEBNISSE 6
2.1 SYNTHESE UND REINIGUNG VON (
14C)-GLUCOSEHALTIGEN OLIGOSACCHARID-SUBSTRATEN 6
2.2 NACHWEIS DER ENDO-MANNOSIDASE-AKTIVITAET IN RATTEN- UND SCHWEINELEBER
7
2.3 AUSARBEITUNG UND OPTIMIERUNG EINES ENZYMASSAYS 11
2.4 REINIGUNG DER ENDO-MANNOSIDASE 12
2.4.1 SOLUBILISIERUNG DER ENDO-MANNOSIDASE-AKTIVITAET 12
\
2.4.2 BINDUNG AN CM-SEPHAROSE 13
2.4.3 CHROMATOGRAPHIE AN DEM COO'-TENTAKELAUSTAUSCHER 13
2.4.4 RECHROMATOGRAPHIE AN CM-SEPHAROSE 14
2.4.5 REINIGUNG DER ENDO-MANNOSIDASE-AKTIVITAET (PEAK I) 15
2.4.5.1 PHENYLSEPHAROSE-CHROMATOGRAPHIE 15
2.4.5.2 CHROMATOGRAPHIE AN HYDROXYLAPATIT 16
2.4.5.3 GELFILTRATION AN SUPERDEX 75 PREP 16
2.4.5.4 HEPARINSEPHAROSE-CHROMATOGRAPHIE 17
2.4.6 REINIGUNG DER ENDO-MANNOSIDASE (PEAK II) 20
2.4.6.1 PHENYLSEPHAROSE-CHROMATOGRAPHIE 20
2.4.6.2 HYDROXYLAPATIT-CHROMATOGRAPHIE 20
2.5 CHARAKTERISIERUNG DER GEREINIGTEN ENDO-MANNOSIDASE-AKTIVITAETEN 22
2.5.1 PH-ABHAENGIGKEIT 22
2.5.2 UNTERSUCHUNGEN ZUR METALLIONENABHAENGIGKEIT 23
2.5.3 HEMMESSUNGEN 23
2.5.4 SUBSTRATSPEZIFITAET DER ENDO-MANNOSIDASE-AKTIVITAETEN 25
2.5.5 DIE 48 UND 50 KDA-SPEZIES SIND NICHT N-GLYCOSYLIERT 26
2.5.6 MOLEKULARGEWICHT DER NATIVEN ENDO-MANNOSIDASE 27
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2.5.7 ISOELEKTRISCHER PUNKT DER ENDO-MANNOSIDASE 28
2.5.8 CHARAKTERISIERUNG DER HYDROLYSEPRODUKTE 32
2.6 HERSTELLUNG UND REINIGUNG POLYKLONALER ANTIKOERPER GEGEN DIE 50
KDA-FORM DER 35
ENDO-MANNOSIDASE
2.6.1 HERSTELLUNG POLYKLONALER ANTIKOERPER GEGEN DIE DENATURIERTE
ENDO-MANNOSIDASE 36
2.6.2 REINIGUNG DER IGG-FRAKTION DURCH PROTEIN A-SEPHAROSE 38
2.6.3 CHARAKTERISIERUNG DER UEBER PROTEIN A-SEPHAROSE GEREINIGTEN
ANTISEREN 38
2.7 SUBZELLULAERE LOKALISATION DER ENDO-MANNOSIDASE IN SCHWEINELEBER 41
2.8 BESTIMMUNG DER SUBZELLULAEREN LOKALISATION DURCH
IMMUNFLUORESZENZMIKROSKOPIE 43
2.8.1 WAHL EINES GEEIGNETEN ZELLSYSTEMS FUER DIE
IMMUNFLUORESZENZ-UNTERSUCHUNG DER 43
ENDO-MANNOSIDASE
2.8.2 IMMUNDETEKTION DER ENDO-MANNOSIDASE IN VERSCHIEDENEN ZELLTYPEN 43
2.8.3 IMMUNFLUORESZENZMIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN 44
3 DISKUSSION 48
4 ZUSAMMENFASSUNG 53
5 MATERIAL UND METHODEN
55
5.1 MATERIALIEN 55
5.1.1 GERAETE 55
5.1.2 ADSORBENTIEN 56
5.1.3 CHEMIKALIEN 56
5.2 METHODEN 58
5.2.1 ALLGEMEINE METHODEN 58
5.2.1.1 PROTEINBESTIMMUNG NACH LARSON 58
5.2.1.2 PROTEINBESTIMMUNG NACH BRAMHALL 58
5.2.1.3 PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD 59
5.2.1.4 RADIOAKTIVITAETSBESTIMMUNG 59
5.2.1.5 SDS-PAGE NACH LAEMMLI 60
5.2.1.6 SILBERFARBUNG VON PROTEINGELEN 61
5.2.1.7 TCA-FAELLUNG 61
5.2.1.8 PROTEINFALLUNG NACH WESSEL UND FLUEGGE 62
5.2.2 ISOLIERUNG VON MIKROSOMEN 62
5.2.2.1 MIKROSOMENPRAEPARATION AUS TIERISCHEN GEWEBEN 62
5.2.2.2 PRAEPARATION VON GOLGI-MEMBRANEN 63
5.2.3 SYNTHESE UND REINIGUNG VON RADIOAKTIV MARKIERTEN OLIGOSACCHARIDEN
63
5.2.3
.1
SYNTHESE VON (14C)-GLCI.3-MAN9-GLCNAC
2
63
5.2.3.2 AUFARBEITUNG DER GLYCOLIPIDE
T 64
5.2.3.3 SCHWACH SAURE HYDROLYSE DER DOL-PP-OLIGOSACCHARIDE 64
5.2.3.4 REINIGUNG DER FREIEN OLIGOSACCHARIDE DURCH HPL-C 64
5.2.4 ENZYMATISCHE MESSUNGEN 65
5.2.4.1 AKTIVITAETSMESSUNG DER ENDO-MANNOSIDASE MIT RADIOAKTIV MARKIERTEN
SUBSTRATEN 65
5.2.4.1.1 NACHWEIS DER HYDROLYSEPRODUKTE DURCH HPLC 65
5.2.4.1.2 NACHWEIS DER HYDROLYSEPRODUKTE DURCH PAPIERCHROMATOGRAPHIE 66
5.2.4.2 MESSUNGEN MIT PARA-NITROPHENYLMANNOSID/GLUCOSID 67
5.2.4.3 MESSUNGEN DER GLUCOSIDASE I UND II AKTIVITAET 67
5.2.4.4 MESSUNG DER GALACTOSYL-TRANSFERASE-AKTIVITAET 67
5.2.4.5 MESSUNG DER PH-ABHAENGIGKEIT 68
5.2.4.6 MESSUNG DER METALLIONENABHAENGIGKEIT 69
5.2.4.7 HEMMESSUNGEN 69
5.2.4.8 CHARAKTERISIERUNG DER HYDROLYSEPRODUKTE 69
5.2.4.9 BEHANDLUNG DER ENDO-MANNOSIDASE MIT GLYCOPEPTIDASE F UND
ENDOGLYCOSIDASE H 70
5.2.4.10 BINDUNGSVERSUCHE DER ENDO-MANNOSIDASE AN CON A-SEPHAROSE 70
5.2.5 PRAEPARATIVE ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG MIT DER ROTOFOR-ZELLE 70
5.2.5
.1
BESTIMMUNG DES ISOELEKTRISCHEN PUNKTES DER ENDO-MANNOSIDASE DURCH 72
CHROMATOFOKUSSIERUNG
5.2.6 REINIGUNG DER ENDO-MANNOSIDASE AUS SCHWEINELEBER 72
5.2.6.1 SOLUBILISIERUNG UND BINDUNG AN CM-SEPHAROSE 72
5.2.6.2 CHROMATOGRAPHIE AN EINEM COO'-TENTAKELAUSTAUSCHER 73
5.2.6.3 GRADIENTENCHROMATOGRAPHIE AN CM-SEPHAROSE 73
5.2.6.4 PHENYLSEPHAROSE-CHROMATOGRAPHIE 74
5.2.6.5 HYDROXYLAPATIT-CHROMATOGRAPHIE 75
5.2.6.6 GELFIHRATION AN SEPHADEX 75 PREP 75
5.2.6.7 CHROMATOGRAPHIE AN HEPARINSEPHAROSE 75
5.2.7 IMMUNOLOGISCHE METHODEN 76
5.2.7.1 HERSTELLUNG VON ANTIKOERPER GEGEN DIE DENATURIERTE
ENDO-MANNOSIDASE (50 KDA- . 76
FORM)
5.2.7.2 REINIGUNG DER IGG FRAKTION DURCH PROTEIN A-CHROMATOGRAPHIE 78
5.2.7.3 ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) 78
5.2.7.4 WESTEMBLOT 80
5.2.7.5 IMMUNPRAEZIPITATION 82
5.2.7.6 IMMUNFLUORESZENZUNTERSUCHUNGEN 82
5.2.7.6.1 KULTIVIERUNG VON COS-ZELLEN 82
5.27.6.2 ZELLEMTE 82
5.2.7.6.3 IMMUNFLUORESZENZMIKROSKOPIE 83
6 LITERATURVERZEICHNIS 84 |
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