Regulation der Zytokin-Genexpression und Mediatoren-Freisetzung aus humanen Monozyten und Makrophagen nach Coxsackievirus-B3-Infektion:
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Marburg
Görich & Weiershäuser
1995
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| Series: | Wissenschaft in Dissertationen
29 |
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INHALT
1.
EINLEITUNG
1
1.1.
COXSACKIEVIRUS-INDUZIERTE
MYOKARDITIS:
EIN
MODELL
1
1.2.
COXSACKIEVIRUS
B3:
CHARAKTERISIERUNG,
STRUKTUR
4
UND
REPLIKATION
1.2.1.
CHARAKTERISIERUNG
UND
STRUKTUR
4
1.2.2.
DER
REPLIKATIONSZYKLUS
5
1.3.
EPIDEMIOLOGIE
UND
PATHOGENITAET
7
1.4.
IMMUNREAKTION
GEGEN
COXSACKIE
B-VIREN
8
1.5.
MONOZYTEN
UND
MAKROPHAGEN
10
1.6.
IMMUNREGULATORISCHE
EFFEKTORMOLEKUELE
12
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
16
2.1.
ZELLEN
UND
ZELLINIEN
16
2.2.
VIREN
16
2.3.
MEDIEN
16
2.4.
METHODEN
ZUR
ISOLIERUNG
UND
KULTIVIERUNG
VON
ZELLEN
17
UND
ZELLINIEN
2.4.1.
KULTIVIERUNG
VON
HELA-ZELLINIEN
17
2.4.2.
UEBERPRUEFUNG
DER
ZELLVITALITAET
18
2.4.2.1.
TRYPAN-BLAU-FAERBUNG
18
2.4.2.2.
MESSUNG
DER
STOFFWECHSELAKTIVITAET
VON
ZELLEN
MIT
MTT
18
2.4.2.3.
VITALITAETSTEST
MIT
EZ
4U
19
2.4.3.
ISOLIERUNG
UND
ANREICHERUNG
HUMANER
BLUTMONOZYTEN
19
2.4.3.1.
NACHWEIS
DER
UNSPEZIFISCHEN
ESTERASE
21
2.4.3.2.
LAL-TEST
ZUM
AUSSCHLUSS
VON
ENDOTOXINKONTAMINATIONEN
21
2.4.3.3.
MYKOPLASMENKONTAMINATIONEN:
NACHWEIS
UND
21
BEKAEMPFUNG
2.4.4.
ISOLIERUNG
VON
NATUERLICHEN-KILLER-ZELLEN
(NK-ZELLEN)
22
2.4.4.1.
PRINZIP
DER
DYNABEAD-ISOLATION
22
2.4.4.2.
KO-KULTUREN
VON
HUMANEN
MONOZYTEN
MIT
AUTOLOGEN
NK-ZELLEN
24
2.4.5.
ISOLIERUNG
VON
CD4
+
-T-LYMPHOZYTEN
MIT
HILFE
DER
MACS
TECHNIK
24
2.4.5.1.
KO-KULTUREN
VON
MONOZYTEN
MIT
CD4*-T-LYMPHOZYTEN
26
2.5.
METHODEN
ZUR
VIRUSVERMEHRUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
27
2.5.1.
COXSACKIEVIRUS
B3:
VERMEHRUNG
UND
HERSTELLUNG
EINES
VIRUSPOOLS
27
2.5.1.1.
NEUTRALISATIONSTEST
ZUR
UEBERPRUEFUNG
DER
SPEZIFITAET
DES
VIRUSISOLATES
27
2.5.2.
VIRUSTITERBESTIMMUNG
MIT
QUANTITATIVEN
METHODEN
28
2.5.2.1.
50%
TISSUE-CULTURE-INFECTIOUS-DOSE
(TCID50)
BESTIMMUNG
28
2.5.2.2.
PLAQUETEST
30
2.6.
METHODEN
ZUR
CHARAKTERISIERUNG
DER
INTERAKTIONEN
ZWISCHEN
ZIELZELLEN
UND
VIREN
31
2.6.1.
VIRUSINFEKTION
VON
MONOZYTEN
UND
MAKROPHAGEN
31
2.6.1.1.
DOPPELIMMUNFLUORESZENZ
32
2.6.1.2.
FACS-ANALYSE
VON
ZELLEN
NACH
CVB3-INFEKTION
32
2.6.2.
LAKTAT-DEHYDROGENASE-ENZYMTEST
33
2.6.3.
TNF-A:
NACHWEIS
IM
BIOSASSAY
34
2.6.4.
IFN-A/SS:
NACHWEIS
IM
BIOASSAY
35
2.7.
ZYTOKINBESTIMMUNG
MIT
ELISA-TECHNIK
36
2.7.1.
ELISA
ZUR
BESTIMMUNG
VON
TNF-A
36
2.7.2.
ELISA
FUER
IL-1
SS,
IL-2,
IL-6,
IL-10
UND
IFN-Y
38
2.8.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
39
2.8.1.
INTRAZELLULAERE
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
NEUSYNTHE
TISIERTEN
PROTEINEN
39
2.8.1.1.
IMMUNPRAEZIPITATION
40
2.8.1.2.
GESAMTPROTEINBANDEN
41
2.8.1.3.
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
41
2.8.1.4.
SDS-GELSYSTEM
NACH
LAEMMLI
(1970)
42
2.8.1.5.
FLUOROGRAPHIE
43
2.8.2.
RNA-PRAEPARATION
43
2.8.3.
NORTHERN-BLOT-ANALYSE
DER
GENEXPRESSION
46
2.8.3.1.
RADIOAKTIVE
HYBRIDISIERUNG
47
2.83.2.
"
P-MARKIERUNG
DER
CDNA-SONDE
48
2.8.4.
CDNA-SONDEN
49
2.8.5.
UMKLONIERUNG
DER
ZYTOKIN
UND
CVB3
CDNA-SONDEN
49
2.8.6.
REVERSE-TRANSKRIPTASE
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
51
(RT-PCR)
2.8.6.1.
CDNA-SYNTHESE
(REVERSE-TRANSKRIPTASE-REAKTION)
51
2.8.6.2.
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
(PCR)
52
2.8.6.3.
CDNA-SONDEN-HERSTELLUNG
DURCH
KLONIERUNG
DER
PCR
53
PRODUKTE
3.
ERGEBNISSE
54
3.1.
COXSACKIEVIRUS
54
3.1.1.
CVB3-INFEKTION
IN
HELA-ZELLEN:
AENDERUNG
DER
55
MORPHOLOGIE
3.1.2.
CVB3-INFEKTION
IN
MONOZYTEN
UND
MAKROPHAGEN:
57
ZELLMORPHOLOGIE,
ADHAERENZ
UND
VITALITAET
3.1.2.1.
MORPHOLOGIE
57
3.1.2.2.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
ADHAERENZ
VON
MONOZYTEN
UND
61
MAKROPHAGEN
3.1.2.3.
CVB3-INFEKTION
UND
VITALITAET
VON
MONOZYTEN
UND
63
MAKROPHAGEN
3.2.
CVB3-REPLIKATION
IN
MONOZYTEN
UND
MAKROPHAGEN
65
3.2.1.
"
S-METHIONINEINBAU
ZUM
NACHWEIS
DER
VIRUSPROTEIN
66
SYNTHESE
3.2.2.
NACHWEIS
DER
CVB3
MINUS-STRANG-RNA
MIT
DER
68
RT-PCR
TECHNIK
3.2.3.
UNTERSUCHUNG
ZUR
PERSISTENZ
VON
CVB3-GENOM
IN
70
MONOZYTEN
UND
MAKROPHAGEN
3.2.3.1.
UNTERSUCHUNG
ZUR
REAKTIVIERUNG
PERSISTIERENDEN
72
CVB3-GENOMS
3.3.
DOPPELIMMUNFLUORESZENZ
ZUM
NACHWEIS
CVB3-INFIZIERTER
74
MONOZYTEN
UND
MAKROPHAGEN
3.3.1.
FACS-ANALYSE
ZUR
QUANTIFIZIERUNG
CVB3-INFIZIERTER
77
MONOZYTEN
3.4.
INTERAKTIONEN
ZWISCHEN
CVB3-INFIZIERTEN
HUMANEN
80
MONOZYTEN
UND
SPEZIFISCHEN
EFFEKTORZELLEN
3.4.1.
CD4
+
-T-LYMPHOZYTEN
80
3.4.1.1.
VIRUSVERMEHRUNG
UND
FREISETZUNG
80
3.4.1.2.
EINFLUSS
VON
CD4*-T-LYMPHOZYTEN
AUF
DIE
TNF-A
81
FREISETZUNG
3.4.1.3.
EINFLUSS
CVB3-INFIZIERTER
MONOZYTEN
AUF
DIE
IL-2
82
FREISETZUNG
3.4.2.
INTERAKTIONEN
ZWISCHEN
MONOZYTEN
UND
NK-ZELLEN
83
NACH
CVB3-INFEKTION
3.5.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
FREISETZUNG
VON
MEDIATOREN
AUS
86
HUMANEN
MONOZYTEN
UND
MAKROPHAGEN
NACH
VIRUS-INFEKTION
3.5.1.
TUMOR-NEKROSE-FAKTOR-ALPHA
(TNF-A)
86
3.5.2.
LNTERLEUKIN-1SS(IL-1SS)
87
3.5.3.
LNTERLEUKIN-6
(IL-6)
88
3.5.4.
LNTERLEUKIN-10
(IL-10)
89
3.5.5.
INTERFERON-A/SS
(IFN-A/SS)
90
3.5.6.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
MEDIATORFREISETZUNG
AUS
IN
VITRO
AUS
91
DIFFERENZIERTEN
HUMANEN
MAKROPHAGEN
NACH
CVB3-INFEKTION
3.6.
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
EINFLUSS
EINER
CVB3-INFEKTION
AUF
93
DIE
ZYTOKIN-GENEXPRESSION
HUMANER
MONOZYTEN
3.6.1.
NORTHERN-BLOT-ANALYSE
DER
CVB3-INDUZIERTEN
ZYTOKIN
94
GENEXPRESSION
3.6.2.
NORTHERN-BLOT-ANALYSE
DER
ZYTOKIN-GENEXPRESSION
IN
96
MONOZYTEN
NACH
LPS-STIMULATION
3.7.
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
EINFLUSS
VON
COXSACKIE-VIRUS
B3
98
AUF
DIE
LPS-INDUZIERTE
ZYTOKINFREISETZUNG
AUS
MONOZYTEN
UND
MAKROPHAGEN
3.7.1.
MONOZYTEN
98
3.7.1.1.
TUMOR-NEKROSE-FAKTOR-ALPHA
98
3.7.1.2.
LNTERLEUKIN-1
SS
99
3.7.1.3.
LNTERLEUKIN-6
100
3.7.1.4.
LNTERLEUKIN-1
0
101
3.8.
NORTHERN-BLOT-ANALYSE
ZUM
EINFLUSS
EINER
CVB3-INFEKTION
102
AUF
DIE
LPS-INDUZIERTE
ZYTOKIN-GENEXPRESSION
IN
MONOZYTEN
3.9.
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
EINFLUSS
VON
COXSACKIE-VIRUS
B3
104
AUF
DIE
LPS-INDUZIERTE
ZYTOKINFREISETZUNG
AUS
MAKROPHAGEN
3.9.1.
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
ABSCHALTEN
DES
INTRAZELLULAEREN
106
STOFFWECHSELS
VON
MAKROPHAGEN
NACH
CVB3-INFEKTION
4.
DISKUSSION
109
4.1.
CVB3-INFEKTION
HUMANER
MONOZYTEN
UND
MAKROPHAGEN
110
4.2.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
ZYTOKINFREISETZUNG
AUS
CVB3
115
INFIZIERTEN
MONOZYTEN
UND
MAKROPHAGEN
4.3.
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
EINFLUSS
EINER
CVB3-INFEKTION
121
AUF
DIE
ZYTOKIN-GENEXPRESSION
5.
ZUSAMMENFASSUNG
130
6.
LITERATUR
132 |
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