Untersuchungen zu den primären Photoprozessen im Phytochrom:
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 PHYSIOLOGISCHE BEDEUTUNG DES PHYTOCHROMSYSTEMS 1
1.2 MOLEKULARE EIGENSCHAFTEN DES PHYTOCHROMS 2
1.2.1 DER CHROMOPHOR 2
1.2.2 DAS APOPROTEIN 4
1.2.3 WECHSELWIRKUNGEN ZWISCHEN CHROMOPHOR UND APOPROTEIN 5
1.3 ZIELE DER ARBEIT 7
G
2 MATERIAL UND METHODEN
2.1 CHEMIKALIEN 8
2.2 ISOLIERUNG VON NATIVEM PHYTOCHROM AUS HAFER
(AVENA SATIVA L.) 8
2.2.1 ANZUCHT DER HAFERKOLEOPTILEN 8
2.2.2 PRAEPARATION DES PHYTOCHROMROHEXTRAKTES 8
2.2.3 IONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE UEBER HYDROXYLAPATIT 10
2.2.4 PARTIELLE SOLUBILISIERUNG 11
2.2.5 FAELLUNG MIT POLYVINYLPYRROLIDON 12
2.3 PRAEPARATION DER CHROMOPROTEINE DES PHYTOCHROMS 12
2.3.1 TRYPSIN-SPALTUNG ZUM 39 KDA CHROMOPROTEIN 13
2.3.2 TRYPSIN-SPALTUNG ZUM 59 KDA PHYTOCHROM 13
2.3.3 AUFREINIGUNG DER PHYTOCHROM-CHROMOPROTEINE DURCH GELFILTRATION 13
2.3 .4 NACHWEIS DER REINHEIT DER PHYTOCHROM-CHROMOPROTEINE 13
2.3.5 KONZENTRIERUNG DER PROBEN 13
2.3.6 SEQUENZANALYSE 14
2.4 CHARAKTERISIERUNG UND NACHWEIS DES PHYTOCHROMS 14
2.4.1 BESTRAHLUNGSEINRICHTUNGEN 14
2.4.2 SDS-ELEKTROPHORESE 14
2.4.3 BESTIMMUNG DER PARTIELLEN QUANTENAUSBEUTEN O
R UND ! & 15
2.4.3.1 METHODE DER FORMALEN INTEGRATION 15
2.4.3 2 EXPERIMENTELLE DURCHFUEHRUNG 16
2.4.4 ERMITTLUNG DER KONZENTRATIONEN AN PR.39 UND PW-39 IM
PHOTOSTATIONAEREN 17
ZUSTAND DES 39 KDA CHROMOPROTEINS NACH SATURIERENDER BESTRAHLUNG MIT
ROTEM LICHT
2.5 SPEKTROSKOPISCHE METHODEN 17
2.5.1 UV/VTS-SPEKTROSKOPIE 17
2.5.2 STATIONAERE FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE 18
2.5.2.1 MESSGERAET 18
2.5.2.2 BESTIMMUNG DER FLUORESZENZQUANTENAUSBEUTE DES 39 KDA CHROMO- 18
PROTEINS
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/945480946
2.5.3 UV-DERIVATIVSPEKTROSKOPIE 18
2.5.4 SINGLE PHOTON COUNTING - MESSUNGEN UND DATENANALYSE 18
2.5.4.1 MESSGERAET UND DATENAUSWERTUNG 18
2.5.4.2 PHYTOCHROMPROBEN FUER DIE SINGLE PHOTON COUNTING-MESSUNGEN 18
2.5.5 FLUORESZENZLOESCHUNG MIT ACRYLAMID 19
2.5.6 MESSUNG DER FT-RESONANZ-RAMAN-SPEKTREN 20
2.5.6.1 FT-RESONANZ-RAMAN-SPEKTROMETER 20
2.5.6.2 MESSUNGEN BEI TIEFTEMPERATUR 20
2.5.6.3 MESSUNG IM AMMONIUMSULFAT-PELLET 20
2.5.7 TRANSIENTE ABSORPTIONSMESSUNGEN IM FEMTOSEKUNDEN-ZEITBEREICH 20
2.5.7.1 MESSAPPARATUR 20
2.5.7.2 PHYTOCHROMPROBEN FUER DIE FS-ABSORPTIONSMESSUNGEN 21
2.6 MODIFIZIERUNG VON SH-GRUPPEN 21
2.6.1 MARKIERUNG VON SH-GRUPPEN MIT 5.5'-DITHIOBIS(2-NITROBENZOESAEURE)
21
(DTNB)
2.6.2 MODIFIZIERUNG VON CYSTEIN-RESTEN MIT N-(IODACETYLAMINOETHYL)-5- 21
NAPHTHYLAMIN-1 -SULFONSAEURE (IAED ANS)
2.6.3 MODIFIZIERUNG VON SH-GRUPPEN MIT N-(9-ACRIDINYL)MALEIMID (NAM) 22
3 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 23
3.1 CHARAKTERISIERUNG DES NATIVEN PHYTOCHROMS 23
3.1.1 ISOLIERUNG DES NATIVEN PHYTOCHROMS 23
3.1.2 ELEKTROPHORETISCHE EIGENSCHAFTEN 23
3.1.3 ABSORPTIONSEIGENSCHAFTEN 24
3.1.4 PARTIELLE QUANTENAUSBEUTEN DER PHOTOTRANSFORMATION 25
3.2 CHARAKTERISIERUNG DES 39 KDA CHROMOPROTEINS 26
3.2.1 PRAEPARATION DES 39 KDA CHROMOPROTEINS 26
3.2.2 ELEKTROPHORETISCHE EIGENSCHAFTEN 27
3.2.3 ERGEBNIS DER SEQUENZANALYSE 28
3.2.4 ABSORPTIONLSEIGENSCHAFTEN 28
3.2.5 GLEICHGEWICHTSKONZENTRATIONEN AN P
R.39 UNDPBI-39 IM PHOTOSTATIONAEREN 30
ZUSTAND DES 39 KDA CHROMOPROTEINS NACH SATURIERENDER BESTRAHLUNG MIT
ROTEM LICHT
3.2.6 PARTIELLE QUANTENAUSBEUTEN DER PHOTOTRANSFORMATION DES 39 KDA 32
CHROMOPROTEINS
3.3 CHARAKTERISIERUNG DES 59 KDA PHYTOCHROMS
33
3.3.1 PRAEPARATION DES 59 KDA PHYTOCHROMS 33
3.3.2 ELEKTROPHORETISCHE EIGENSCHAFTEN 34
3.3.3 ERGEBNIS DER SEQUENZANALYSE 35
3.3.4 ABSORPTIONSEIGENSCHAFTEN 35
3.4 VERGLEICHENDE UNTERSUCHUNGEN ZUR PHOTOTRANSFORMATION IM 39 KDA 36
UND 59 KDA PHYTOCHROM MIT HILFE DER FT-RESONANZ-RAMAN-TECHNIK
3.4.1 UNTERSUCHUNGEN ZUR PHOTOTRANSFORMATION DES 59 KDA PHYTOCHROMS 37
3.4.2 UNTERSUCHUNGEN ZUR PHOTOTRANSFORMATION DES 39 KDA CHROMOPROTEINS
39
3.5. UNTERSUCHUNG DER FUNKTION VON TRYPTOPHAN-RESTEN UND SH- 42
GRUPPEN BEI DER PHOTOTRANSFORMATION DES PHYTOCHROMS
3.5.1 UNTERSUCHUNGEN AN TRYPTOPHAN-RESTEN 42
3.5.1.1 UV-DERIVATIVSPEKTROSKOPIE 42
3.5.1.2 TRYPTOPHAN ALS INTRINSISCHE FLUORESZENZSONDE 44
3.5.1.3 UNTERSUCHUNG DER EXPONIERUNG VON TRYPTOPHAN-RESTEN DURCH
LOESCHUNG 54
DER TRYPTOPHANFLUORESZENZ MIT ACRYLAMID
3.5.2 MODIFIZIERUNG VON SH-GRUPPEN 57
3.5.2.1 MODIFIZIERUNG VON CYSTEIN-RESTEN MIT
5.5'-DITHIOBIS(2-NITROBENZOE-
SAEURE) (DTNB) 57
3.5.2.2 FLUORESZENZMARKIERUNG VON CYSTEIN-RESTEN MIT
N-(IODACETYLAMINOETHYL)-
5-NAPHTHYLAMIN-1 -SULFONSAEURE (IAEDANS) 59
3.5.2.3 MODIFIZIERUNG VON SULFHYDRYLGRUPPEN MIT N-(9-ACRIDINYL)MALEIMID
(NAM) 61
3.6 UNTERSUCHUNGEN ZU DEN PRIMAEREN PHOTOPHYSIKALISCHEN PROZESSEN IM
NATIVEN PHYTOCHROM DURCH TRANSIENTE ABSORPTIONSMESSUNGEN IM
FEMTOSEKUNDEN-ZEITBEREICH 63
4 ZUSAMMENFASSUNG 68
5 LITERATURVERZEICHNIS 70 |
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