Untersuchungen zur Signaltransduktion in Tumorzellen: Substrate der Rezeptortyrosinkinase Xmrk von Xiphophorus
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| adam_text | UNTERSUCHUNGEN ZUR SIGNALTRANSDUKTION IN TUMORZELLEN: SUBSTRATE DER
REZEPTORTYROSINKINASE XMRK VON XIPHOPHORUS DISSERTATION ZUR ERLANGUNG
DES NATURWISSENSCHAFTLICHEN DOKTORGRADES DER BAYERISCHEN
JULIUS-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET WORZBURG VORGELEGT VON CLAUDIA WELLBROCK
AUS FLENSBURG WUERZBURG, 1995 INHALTSVERZEICHNISS 1. EINLEITUNG
SIGNALTRANSDUKTION IN TUMORZELLEN 1 XIPHOPHORUS ALS EIN IN VIVO SYSTEM
FUER MOLEKULARE TUMORGENETIK 9 ZIELSETZUNG 13 2. MATERIAL 2.1. 2.2. 2.3.
2.4. 2.5. 2.6. 2.7. 2.8. 2.9. ZELLINIEN FISCHE BAKTERIEN MEDIEN UND
PUFFERLOESUNGEN VEKTOREN UND OLIGONUKLEOTIDE (PCR PRIMER) ENZYME UND
ENZYMKITS CHEMIKALIEN UND RADIOCHEMIKALIEN ANTIKOERPER GERAETE 15 15 16
16 17 18 19 19 21 3. METHODEN 3.1. KONSTRUKTION BAKTERIELLER
GST-EXPRESSIONSPLASMIDE 3.1.1. ISOLIERUNG VON PLASMID DNA AUS E.COLI 22
3.1.2 PRAEPARATIVE PCR ( POLYMERASE CHAIN REACTION ) 22 3.1.3. SPALTUNG
VON DNA MIT RESTRIKTIONSENDONUCLEASEN 23 3.1.4. AUFTRENNUNG UND
ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN MITTELS AGAROSE GELELEKTROPHORESE 23
3.1.5. LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN 24 3.1.6. TRANSFORMATION KOMPETENTER
BAKTERIENZELLEN 24 3.1.7. SEQUENZANALYSE VON DNA 25 3.2. EXPRESSION VON
GST-FUSIONSPROTEINEN IN ECOLI 25 3.3. ANALYSE VON PROTEINEN 3.3.1.
BRADFORD PROTEINBESTIMMUNG 26 3.3.2. DENATURIERENDE
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 27 3.3.3. WESTERN BLOT
ANALYSE 28 3.4. ZELLKULTUR UND ZELLAUFSCHLUSSVERFAHREN 3.4.1.
KULTIVIERUNG EUKARYOTISCHER ZELLEN 28 3.4.2. METABOLISCHE MARKIERUNG
EUKARYOTISCHER ZELLEN 29 3.4.3. TYRPHOSTIN-BEHANDLUNG EUKARYOTISCHER
ZELLEN 29 3.4.4. KULTIVIERUNG UND INFEKTION VON SF9 ZELLEN 30 3.4.5.
AUFSCHLUSS EUKARYOTISCHER ZELLEN ZUR GEWINNUNG ZELLULAERER PROTEINE 30
3.5. QUALITATIVE BINDUNGSSTUDIEN MIT REKOMBINANTEN SH2 DOMAENEN-PROTEINEN
31 3.6. QUANTITATIVE BINDUNGSSTUDIEN MIT REKOMBINANTEN SH2
DOMAENEN-PROTEINEN 31 3.7. DETEKTION VON PROTEINEN DURCH SPEZIFISCHE
NACHWEISVERFAHREN 3.7.1. IMMUNPRAEZIPITATION 32 3.7.2 IN VITRO
PHOSPHORYLIERUNG 32 3.7.3. ENOLASE-PHOSPHORYLIERUNG 33 3.7.4. PL
3-KINASE NACHWEIS 33 3.7.5. REZEPTOR BLOT 34 4. ERGEBNISSE 4.1.
UNTERSUCHUNGEN ZUR INTERAKTION BEKANNTER RTK-SUBSTRATE MIT DEM REZEPTOR
XMRK 4.1.1. IN VITRO BINDUNGSSTUDIEN MIT SH2 DOMAENEN FUSIONSPROTEINEN
4.1.1.1. KONSTRUKTION UND EXPRESSION VON SH2 DOMAENEN FUSIONSPROTEINEN 37
4.1.1.2. BINDUNG VON XMRK AN HPLCY-SH2 40 4.1.1.3. BINDUNG VON XMRK AN
DIE SH2 DOMAENEN VON XSRC, XFYN UND XYES 44 4.1.1.4. VERGLEICHENDE
BINDUNGSSTUDIEN DER SH2 DOMAENEN VON HPLCY, XSRC, XFYN UND XYES UND
BESTIMMUNG DER RELATIVEN BINDUNGSAFFINITAETEN 46 4.1.2. DETEKTION VON
BEKANNTEN RTK-SUBSTRATEN DURCH KOIMMUN- PRAEZIPITATION UND MITTELS
SPEZIFISCHER NACHWEISVERFAEHREN 4.1.2.1. PLCY: NACHWEIS EINER INTERAKTION
MIT XMRK DURCH KOIMMUNPRAEZIPITATION 49 4.1.2.2. XFYN : NACHWEIS EINER
INTERAKTION MIT XMRK DURCH KOIMMUNPRAEZIPITATION UND MITTELS
SUBSTRAT-PHOSPHORYLIERUNG 51 4.1.2.3. PL 3-KINASE : NACHWEIS EINER
INTERAKTION MIT XMRK DURCH KOIMMUNPRAEZIPITATION UND PL 3-KINASE ANALYSE
54 4.1.2.4. GRB2: NACHWEIS EINER INTERAKTION MIT XMRK DURCH
KOIMMUNPRAEZIPITATION 57 4.2. IDENTIFIZIERUNG PUTATIVER SUBSTRATE DES
REZEPTORS XMRK 4.2.1. DETEKTION TYROSINPHOSPHORYLIERTER ZELLULAERER
PROTEINE VOR UND NACH STIMULATION DER KINASEAKTIVITAET DES REZEPTORS
4.2.2. HEMMUNG DER PHOSPHORYLIERUNG ZELLULAERER PROTEINE DURCH
SPEZIFISCHE RTK-INHIBITOREN (TYRPHOSTINE) 4.2.3. REZEPTOR- BLOT 59 60 62
5. DISKUSSION PLCY ALS SUBSTRAT VON XMRK 65 INTERAKTION SRC-VERWANDTER
KINASEN MIT XMRK IN VITRO 66 ASSOZIATION VON XFYN MIT XMRK IN VIVO 68
ASSOZIATION EINER PL 3-KINASEAKTIVITAET MIT XMRK 70 BINDUNG VON GRB2 AN
XMRK 72 XMRK-SPEZIFISCHE SUBSTRATPROTEINE 73 DIE ROLLE DER
XMRK-ASSOZIIERTEN SUBSTRATPTOTEINE; EIN XMRK-SIGNALTRANSDUKTIONS MODELL
75 6. ZUSAMMENFASSUNG 81 7. ANHANG EXPRESSION AKTIVER TYROSINKINASEN IN
E.COLL 7.1. EXPRESSION VON XSRC, XFYN UND XYES IN E.COLI 84 7.2.
UNTERSUCHUNG DER TYROSINPHOSPHORYLIERUNG VON XSRC 86 XFYN UND XYES IN
E.00B 7.3. DISKUSSION 89 LITERATURVERZEICHNIS 91 ABKUERZUNGEN 103
VEROEFFENTLICHUNGEN 1Q5 LEBENSLAUF *) RJ6
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