Reparatur von Methylierungsschäden der DNA: konstitutive Expression und Induzierbarkeit der O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase und der N-Methylpurin-DNA-Glykosylase in Säugerzellen
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Karlsruhe
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1995
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Zusammenfassung
Abstract
Abkürzungen
Einleitung 1
Material 13
Methoden 18
1. Kultivierung etablierter Zellinien 18
1.1. Behandlung von Zellen mit Alkylantien, TPA und Forskolin 18
1.2. Bestrahlung von Zellen 19
1.3. Dosis-Effekt-Versuche 19
1.4. Transiente Transfektion durch Kalziumphosphat Kopräzipitation 19
2. Kultivierung von primären Ratten-Hepatozyten als Sphäroide 20
2.1. Isolierung von Ratten-Hepatozyten 20
2.1.1. Perfusion der Rattenleber 20
2.1.2. Anreicherung vitaler Hepatozyten 21
2.2. Sphäroidbildung und Kultivierung 22
2.3. Behandlung von Sphäroiden mit Alkylantien und Tumorpromotoren 22
2.4. Bestrahlung von Sphäroiden mit Röntgenstrahlen 22
3. Kultivierung von £.co//-Bakterien 22
3.1. Transformation von E.coli Bakterien 23
3.1.1. Elektroporation 23
3.1.1.1. Präparation der Zellen 23
3.1.1.2. Transformation 23
3.1.2. Transformation mit Kalziumchlorid (verändert nach Maniatis et al., 1982) 23
3.1.2.1. Herstellung kompetenter Zellen 23
3.1.2.2. Transformation 23
4. Herstellung von Gesamtzellextrakt aus Säugerzellen 24
5. Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford 24
6. Messung von Enzymaktivitäten 24
6.1. O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase Aktivität 24
6.2. Methylpurin-DNA-Glykosylase Aktivität 25
6.3. Chloramphenicol-Acetyltransferase Aktivität 26
6.4. ß-Galaktosidase Aktivität 27
7. Präparation von Nukleinsäuren 28
7.1. Präparation von Plasmid-DNA aus Bakterien 28
7.1.1. Präparation kleiner Mengen 28
7.1.2. Präparation großer Mengen 28
7.2. Präparation von RNA aus Säugerzellen 28
8. Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 29
9. Gelelektrophoretische Trennung von Nukleinsäuren 29
9.1. Agarose-Gelelektrophorese von Nukleinsäuren 29
9.1.1. DNA 29
9.1.2. RNA 29
9.2. Polyacrylamid-Gelelektrophorese von DNA-Fragmenten 30
10. Nachweis von Nukleinsäurefragmenten durch Blot- und Hybridisierungstechniken 30
10.1. Transfer von Nukleinsäuren auf Membranen (Southern-, Northern-Blot) 30
10.2. Herstellung radioaktiver DNA-Sonden 30
10.3. Hybridisierung von Nukleinsäuren und Autoradiographie 31
11. Isolierung von DNA-Sequenzen aus einer Cosmidgenbank durch
„Kolonie-Hybridisierung 32
12. Klonierung von DNA in E.coli 33
12.1. Restriktion von DNA 33
12.2. DNA-Isolierung aus Agarosegelen 33
12.3. Modifizierungen von fragmentierter DNA 33
12.3.1. Dephosphorylierung von DNA-Enden 33
12.3.2. Herstellung von DNA-Fragmenten mit stumpfen Enden (blunt ends) 34
12.4. Ligation 34
13. In vitro Synthese von DNA 35
13.1. Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) mittels Taq-Polymerase 35
13.2. Synthese durch Reverse Transkription 35
14. Sl-Nuklease-Protektionsanalyse 36
15. Sequenzierung von DNA 36
Ergebnisse 38
1. Basale und induzierte Expression der MGMT und der MPG in Hepatomzellinien und in
primären Hepatozyten der Ratte 38
1.1. Basale Expression der MGMT und MPG in Ratten-Leberzellen 39
1.1.1. Basale MGMT- und MPG-Aktivität 39
1.1.2. Basale MGMT- und MPG-mRNA Expression 41
1.2. Expression der MGMT und der MPG nach Einwirkung DNA schädigender
Agenzien 43
1.2.1. Induzierbarkeit der MGMT 44
1.2.2. Induzierbarkeit der N-Methylpurin-DNA-Glykosylase 46
1.3. Expression der MGMT und MPG nach Behandlung von primären Ratten-
Hepatozyten mit dem Tumorpromotor Phenobarbital 47
1.4. Sensitivität der Ratten-Hepatomzellen gegenüber der toxische Wirkung von
Alkylantien 48
2. Untersuchungen zur Induzierbarkeit von Genen der DNA-Exzisionsreparatur und des
MGMT-Gens in H4IIE Ratten-Hepatomzellen 52
2.1. Expression von DNA-Reparaturgenen in H4ÜE-Zellen nach Behandlung mit
Mutagenen 52
2.1.1. Abhängigkeit der MGMT- und MPG-mRNA-Expression von der
Mutagendosis 52
2.1.2. Expression von Reparaturgenen nach Einwirkung von Röntgenstrahlen 54
2.1.3. Expression von Reparaturgenen nach Behandlung mit MNNG 56
2.2. DNA-Reparaturgene sind in der Ratten-Hepatomzellinie H4IIE durch Dexamethason
induzierbar 58
3. Analyse der Induzierbarkeit des menschlichen MGMT-Promotors 61
3.1. Aktivität des menschlichen MGMT-Promotors in der Ratten-Hepatomzellinie H4IIE
nach Einwirkung DNA-schädigender Agenzien 63
3.1.1. Der menschliche MGMT-Promotor ist in H4IIE-Rattenzellen aktiv 63
3.1.2. Der menschliche MGMT-Promotor wird in H4IIE-Rattenzellen aktiviert 64
3.2. Die Promotoraktivität des humanen MGMT-Gens ist durch TPA, Forskolin und
Dexamethason induzierbar 65
4. Isolierung und Charakterisierung des MPG-Promotors der Ratte 68
4.1. Isolierung eines genomischen Fragments des MPG-Gens aus einer Cosmid-Genbank
der Ratte 68
4.2. Kartierung eines Cosmids mit genomischen MPG-Sequenzen 69
4.3. Sequenzierung des potentiellen Promotorbereichs des MPG-Gens der Ratte 71
4.4. Identifizierung des Transkriptionsstartpunktes des MPG-Gens der Ratte 72
4.5. Funktionelle Charakterisierung des potentiellen Promotorbereichs des MPG-Gens
der Ratte 75
4.5.1. Charakterisierung des MPG-Promotors durch Reportergen-Analysen 75
4.5.2. Potentielle Transkriptionsfaktor-Bindestellen im MPG-Promotor 77
4.5.3. Die Aktivität des klonierten MPG-Promotors ist induzierbar 78
Diskussion 81
Literaturverzeichnis 98
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